Диссертация (1140145), страница 12
Текст из файла (страница 12)
И.М.Сеченова Т.В. Антоновой и врачом отделения М.Ю. Коньковым на аппарате«Fujinon EG-250WR5» (Япония): оценивались состояние слизистой оболочкиразличных отделов желудка и 12-перстной кишки для диагностики язвеннойболезни, эрозивного гастрита, портальной гастропатии, опухолевых процессов,наличия визуальных признаков атрофических изменений слизистой. Средиэндоскопических(narrowbandметодикimaging,применяласьNBI)-узкоспектральнаявизуализацииструктурывидеоэндоскопияткани засчетвоспроизведения изображения в узком диапазоне световых волн.2.4 Гистологические методы исследованияПроведение ЭГДС преследовало также взятие биопсий для определения степениатрофических изменений согласно рекомендациям Российского ОбществаПатологоанатомов и международной системы OLGA (Operative Link on GastritisAssessment): 2 фрагмента слизистой оболочки антрального отдела, угол желудка, 2фрагмента слизистой оболочки тела желудка по большой и малой кривизне(Рисунок 10).Рисунок 10 - Схема забора материала для оценки стадии хронического гастрита и степениатрофических изменений слизистой оболочки желудка по системе OLGA.
1 – большаякривизна антрального отдела, 2 – малая кривизна антрального отдела, 3 – угол желудка, 4– малая кривизна тела желудка и 5 – большая кривизна тела желудка (По Rugge M., 2008)59Материал фиксировали в 10% формалине. Парафиновые срезы готовилитрадиционным методом. Полученные срезы окрашивали гематоксилин-эозином.Морфологическоеисследованиепроводилосьнакафедрепатологическойанатомии им. акад.
А.И.Струкова Первого МГМУ им. И.М. Сеченова профессором,д.м.н. А.С. Тертычным.Характер изменений слизистой оболочки желудка оценивался в соответствии смеждународными рекомендациями по оценке патологических изменений (OLGAsystem): поверхностный гастрит, атрофический с указанием степени атрофии,определение степени и выраженности воспаления, а также наличие или отсутствиеочагов кишечной метаплазии. Выявленные патологические изменения оценивалипо градации - слабые, умеренные, выраженные с помощью визуально-аналоговойшкалы (Рисунок 11 и 12).Рисунок 11 - Оценка стадии хронического гастрита (выраженность атрофии)(По Rugge M., 2008)60Рисунок 12 - Оценка степени хронического гастрита (выраженностьвоспаления) (По Rugge M., 2008)Кроме того, было проведено иммуногистохимическое исследование - методпатологоанатомического исследования, основанный на иммунных реакцияхантиген-антитело, позволяющий выявить и локализовать тот или иной антиген втканевых срезах.
В качестве маркера был выбран хромогранин А. Данный белокявляется одним из компонентов секреторных гранул нейроэндокринных клеток ипозволяет оценить их наличие в слизистой оболочке различных отделов желудка.2.5 Иммуноферментный анализЗабор крови производился строго согласно инструкции производителя. Кровьотбирали в сывороточные пробирки, затем их центрифугировали в течение 15 минпри 2000 об/мин.
Пробы сыворотки разливали в пробирки и хранили вхолодильнике при температуре -70оС до момента выполнения анализа.Иммунологическоеиммунологическойисследованиелабораториизав.лабораторией А.Г.Серова.проводилосьПервогоМГМУвим.межклиническойИ.М.Сеченова,612.5.1. Количественное определение аутоантител класса G к париетальнымклеткам желудка (ORGENTEC Anti-Parietal Cell (H+/K+-ATPase), ORGENTECDiagnostika GmbH, Германия)Принцип метода.
Определение антител происходит с помощью непрямогоиммуноферментного анализа. Антитела в образцах сыворотки пациента реагируютс антигенами, нанесенными на ячейки микропланшета. При промывке удаляютсявсе несвязанные компоненты. При последующей инкубации с ферментнымконъюгатом пероксидазы хрена образуются комплексы конъюгат-антителоантиген.
При промывке удаляется несвязавшийся конъюгат.Далее вмикропланшеты добавляют ТМБ (3,3', 5,5'-тетраметилбензидин) и инкубируют 15мин: происходит гидролиз образовавшихся комплексов с появлением голубогоокрашивания. Затем добавляют стоп-агент и окрашивание меняется на желтое.Интенсивность желтого цвета коррелирует с концентрацией комплекса антителоантиген и может быть измерена фотометрически при длине волны 450 нм.Приготовление реагентов.Все реагенты и микропланшет прогревают до комнатной температуры(20…25С).Приготовление буфера для образцов: перед использованием содержимоефлакона с концентратом буфера для образцов разбавляется дистиллированнойводой до конечного объема 100 мл (20 мл концентрата и 80 мл воды).Приготовление буферного промывочного раствора: перед использованиемсодержимое флакона с концентратом промывочного буфера разбавляетсядистиллированной водой до конечного объема 1000 мл (20 мл концентрата и 980мл воды).Приготовление образцов: перед использованием все пробы пациентовразбавляются в 100 раз буфером для образцов (10 мкл образца и 990 мкл буферадля образцов), хорошо перемешиваются.Контроли готовы к использованию и не требуют разбавления.62Методика исследования.1.
Подготовляется достаточное количество стрипов для постановки контролей,калибраторов и предварительно разбавленных проб пациентов в дублях.2. В ячейки добавляют по 100 мкл соответствующих калибраторов, контролей ипредварительно разбавленных образцов пациентов.3. Инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре (20 - 28 °C).4. Затем содержимое ячеек удаляют и трижды промывают 300 мкл промывочногораствора.5. В каждую ячейку добавляют 100 мкл раствора ферментного коньюгата.6. Инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре.7. Затем содержимое ячеек удаляют и трижды промывают 300 мкл промывочногораствора.8.
В каждую ячейку добавляют 100 мкл субстрата TMБ.9. Инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре.10. Затем в каждую ячейку добавляют 100 мкл стоп-раствора и выдерживают 5минут.11. Оптическую плотность получившегося раствора оценивается с помощьюмикропланшетного ридера при длине волны 450 нм.12.
Для автоматического установления концентрации антител к париетальнымклеткамиспользовалиполиноминальнойкомпьютерныекривой,построеннойпрограммы,покоторыекалибровочнымнаосновезначениям,устанавливали неизвестную концентрацию антител.В соответствии с инструкцией фирмы производителя титры антител менее 10Ед/мл расцениваются как отрицательный результат, выше 10 Ед/мл –положительный результат.632.5.2. Тест-система «Гастропанель» («Биохит», Финляндия)Степень выраженности развития атрофических изменений в слизистой оболочкежелудка определялась в том числе и серологическим методом, используя тестсистему «Гастропанель» («Биохит», Финляндия).Накануне взятия крови (начиная с 24 часов) пациенты не пили, не принималипищу, не курили.
Забор крови для определения уровня пепсиногена I, пепсиногенаII, базального гастрина-17 и IgG антител к H.pylori производился за 12-24 часа илипосле проведения ЭГДС. Эндоскопическое исследование может повлиять навыработку гастрина и, таким образом, привести к недостоверности результата.Для определения пепсиногена I, пепсиногена II, гастрина-17 и IgG антител кH.pylori использовали специфические наборы для иммуноферментного анализа:пепсиноген I ИФА набор Cat. No. 601 010.01; пепсиноген II ИФА набор Cat. No.
601020; гастрин-17 ИФА набор Cat. No. 601 035; антитела IgG к H.pylori ИФА наборCat. No. 601 040.02.Определение пепсиногена I.Определение PGI основано на сэндвич-методе ИФА с использованиемспецифических иммобилизированных PGI антител, адсорбированых на лункахмикропланшета, и связывающих антител, коньюгированых с пероксидазой хрена(HRP).Принцип метода.
Моноклональные антитела, специфичные к человеческомуPGI, адсорбированные на поверхности лунок связывают молекулы PGI,представленные в образце.Лунки микропланшета промывают для удаления не связавшихся компонентов.HRP-коньюгированные выявляющие антитела (конъюгат) добавляют в лунки, иони связываются с молекулами PGI. Несвязанный конъюгат удаляется из лунок припромывании, в лунки вносится субстрат (TMB). Субстрат окисляется ферментомдо получения окрашенного в синий цвет конечного продукта. Ферментативнаяреакция прекращается после внесения останавливающего раствора. Интенсивность64окрашивания в желтый цвет прямо пропорциональна концентрации PGI висследуемом образце.Приготовление реагентов.Все реагенты и микропланшет прогревают до комнатной температуры(20…25С), инкубатор до 37С.Промывающий буфер разбавляют 1:10 (100мл + 900мл) дистиллированнойводой.Образцы сыворотки разводят буфером для разведения 1:10 (50 мкл + 450 мкл) итщательно перемешивают.Методика исследования.1.
В лунки микропланшета вносят по 100 мкл раствора бланка, калибраторов,контроля и разведенных образцов. Закрывают лунки клейкой пленкой иинкубируют 60 мин при 37С.2. Каждую лунку микропланшета промывают 3 раза 350 мкл рабочего растворапромывающего буфера.3. С помощью дозатора во все лунки микропланшета вносят по 100 мклраствора конъюгата. Закрывают лунки клейкой пленкой и инкубируют 30 мин винкубаторе при 37С.4. Каждую лунку микропланшета вновь промывают 3 раза 350 мкл рабочегораствора промывающего буфера.5. С помощью дозатора во все лунки микропланшета вносят по 100 мклраствора субстрата.
Закрывают лунки клейкой пленкой и инкубируют 30 мин втемном месте при комнатной температуре (20…25С).6. С помощью дозатора во все лунки микропланшета вносят по 100 мклостанавливающего раствора.7. Оптическую плотность получившегося раствора оценивается с помощьюмикропланшетного ридера при длине волны 450 нм.658.
Для автоматического установления концентрации PG I использоваликомпьютерные программы, которые на основе полиноминальной кривой,построеннойпокалибровочнымзначениям,устанавливалинеизвестнуюконцентрацию PG I.Согласно инструкции производителя, нормальными значениями PG I являетсядиапазон 30-165 мкг/л. Низкие значения PGI (PGI 25 мкг/л) свидетельствуют оумеренном или тяжелом атрофическом гастрите с поражением слизистой оболочкитела желудка.Определение пепсиногена II.Определение PGII основано на сэндвич-методе ИФА с использованиемспецифических иммобилизированных антител к PGII, адсорбированых на лункахмикропланшета, и связывающих антител, коньюгированых с пероксидазой хрена(HRP).Принцип метода.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
