Диссертация (1140128), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Измерение оптической плотности проводили41с помощью спектрофотометра в двуволновом режиме: основной фильтр –450 нм, референс-фильтр – в диапазоне 620-655 нм. Интенсивность желтогоокрашивания была пропорциональна концентрации содержащегося в образцеФНО-α. После измерения оптической плотности раствора в лунках наосновании калибровочного графика рассчитывали концентрацию ФНО-α ванализируемых образцах.2.2.2 Иммуноферментное определение концентрации ИЛ-8 всыворотке кровиМетод определения основан на твердофазном «сэндвич» - вариантеиммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являлисьмоноклональные антитела к ИЛ-8, сорбированные на поверхности лунокразборного полистирольного планшета, конъюгат поликлональных антител кИЛ-8 с биотином и калибровочные образцы, содержащие ИЛ-8.На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцыинкубировали2часаиммобилизированнымисвязываетсясвшейкереантителами.иммобилизованнымиприСи700ИмеющийсявобразцахИЛ-8антителами.СвязавшийсяИЛ-837об/мин.свзаимодействовал при инкубации 1 час в шейкере при 37С и 700 об/мин.
сконъюгатом №1 (антитела к ИЛ-8 человека с биотином). На третьей стадиисвязавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации 30 мин при 37Си 700 об/мин с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена).Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией сиспользованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода ихромогена-тетраметилбензидина, после инкубации на протяжении 25 минпри 18-25С. Измерение оптической плотности проводили с помощьюспектрофотометра в двуволновом режиме: основной фильтр – 450 нм,референс-фильтр – в диапазоне 620-655 нм. Интенсивность желтогоокрашивания была пропорциональна концентрации содержащегося в образцеИЛ-8. После измерения оптической плотности раствора в лунках на42основании калибровочного графика рассчитывали концентрацию ИЛ-8 ванализируемых образцах.2.2.3 Иммуноферментное определение концентрации ИФН-α всыворотке кровиМетод определения основан на твердофазном «сэндвич» - вариантеиммуноферментного анализа.
Специфическими реагентами набора являлисьмоноклональные антитела к ИФН-α, сорбированные на поверхности лунокразборного полистирольного планшета, конъюгат моноклональных антител кИФН-α с пероксидазой хрена и калибровочные образцы, содержащие ИФН-α.На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцыинкубировали 2 часа в шейкере при 18-25 С и 700 об/мин. симмобилизированнымисвязывалсясантителами.ИмеющийсявобразцахИФН-αиммобилизованнымиантителами.СвязавшийсяИФН-αвзаимодействовал при инкубации 1 час в шейкере при 18-25С и 700 об/мин. сконъюгатом антител к ИФН-α человека с пероксидазой хрена.
Количествосвязавшегося конъюгата определяли цветной реакцией с использованиемсубстратапероксидазыхрена–перекисиводородаихромогена-тетраметилбензидина, после инкубации на протяжении 25 мин при 18-25С.Измерение оптической плотности проводили с помощью спектрофотометра вдвуволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – вдиапазоне620-655нм.Интенсивностьжелтогоокрашиваниябылапропорциональна концентрации содержащегося в образце ИФН-α. Послеизмеренияоптической плотности раствора в лунках накалибровочногографикарассчитывалианализируемых образцах.43концентрациюоснованииИФН-αв2.2.4 Иммуноферментное определение концентрации ИЛ-18 всыворотке кровиМетод определения основан на твердофазном «сэндвич» - вариантеиммуноферментного анализа с применением двух типов моноклональныхантител с различной эпитопной специфичностью к ИЛ-18.На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцыинкубировали2часавшейкерепри37Си700об/мин.симмобилизированными антителами к ИЛ-18.
Имеющийся в образцах ИЛ-18связывалсясиммобилизованнымиантителами.СвязавшийсяИЛ-18взаимодействовал при инкубации 1 час в шейкере при 37С и 700 об/мин. сконъюгатом №1 (антитела к ИЛ-18 человека с биотином). На третьей стадиисвязавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации 30 мин при 37Си 700 об/мин с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена).Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией сиспользованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода ихромогена-тетраметилбензидина, после инкубации на протяжении 25 минпри 18-25С. Измерение оптической плотности проводили с помощьюспектрофотометра в двуволновом режиме: основной фильтр – 450 нм,референс-фильтр – в диапазоне 620-655 нм.
Интенсивность желтогоокрашивания была пропорциональна концентрации содержащегося в образцеИЛ-18. После измерения оптической плотности раствора в лунках наосновании калибровочного графика рассчитывали концентрацию ИЛ-18 ванализируемых образцах.2.2.5 Иммуноферментное определение концентрации ИЛ-1β всыворотке кровиМетод определения основан на твердофазном «сэндвич» - вариантеиммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональныхантител к ИЛ-1 β.На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцыинкубировали2часавшейкере44при37Си700об/мин.симмобилизированнымисвязывалсясантителами.ИмеющийсявобразцахИЛ-1βиммобилизованнымиантителами.СвязавшийсяИЛ-1βвзаимодействовал при инкубации 1 час в шейкере при 37С и 700 об/мин.
сконъюгатом №1 (антитела к ИЛ-1β человека с биотином). На третьей стадиисвязавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации 30 мин при 37Си 700 об/мин с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена).Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией сиспользованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода ихромогена-тетраметилбензидина, после инкубации на протяжении 25 минпри 18-25С. Измерение оптической плотности проводили с помощьюспектрофотометра в двуволновом режиме: основной фильтр – 450 нм,референс-фильтр – в диапазоне 620-655 нм. Интенсивность желтогоокрашивания была пропорциональна концентрации содержащегося в образцеИЛ-1β. После измерения оптической плотности раствора в лунках наосновании калибровочного графика рассчитывали концентрацию ИЛ-1β ванализируемых образцах.
[44]2.3 Статистический анализ.Статистический анализ проводили с использованием программыStatisticaверсиииспользованиемпоказатели,10.0.методаоценкуУчитывая,ОТ-ПЦРзначимостичторезультатыпредставляютразличийвисследованиясобойгруппахскачественныепроводилисиспользованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Различиясредних величин считали статистически значимыми при р<0,05.Для обработки результатов исследования цитокинов с использованиемметодаИФАприменялинепараметрическиеметодыстатистическогоанализа, а именно критерий Вальда- Вольфовица и критерий КолмогороваСмирнова. Различия средних величин считали статистически значимыми прир<0,05.45Для расчета показателей диагностической эффективности методапроводилось построение ROC-кривых с использованием следующих формул:чувствительность(%)=истинноположительныйрезультат/(истинноположительный результат + ложноотрицательный результат) ´ 100%;специфичность(%)=истинноотрицательныйрезультат/(истинноотрицательный результат + ложноположительный результат) ´ 100%;Исследование корреляционной связи проводили с использованиемнепараметрического метода статистического анализа – гамма-корреляции.Результат считался статистически значимым при р<0,05.Для оценки связи между развитием обострения ГПА в течение одногогода и наличием фактора риска (изменения цитокинов) проводилосьстатистическое исследование c применением метода отношения шансов.Р<0,05 указывало на статистическую значимость.46Глава 3.
Результаты3.1 Клиническая характеристика обследованных больных ГПАОбследовано 60 больных (21 мужчина и 39 женщин) в возрасте от 18 до80 лет с установленным диагнозом ГПА. Средний возраст обследованныхбольных составлял 48,9±15,6 лет. Диагноз ГПА (n=60) был установлен всоответствии с номенклатурой, принятой в 2012 году на конференции вЧапел-Хилл (США), а также на основании наличия по крайней мере 2 из 4критериев Американской коллегии ревматологов (АCR), 1990 г.
[22] Дляподтверждения диагноза ГПА у 40 (66,7%) больных была выполненабиопсия: слизистой носа или придаточных пазух носа - у 17 (28,3%) больных,образования гортани - у 5 (8,3%) человек, биопсия орбиты - у 12 (20,0%),кожи – у 1 (2,3%), барабанной полости – у 1 (2,3%), легких – у 1 (2,3%),бронхов – у 1 (2,3%), конъюнктивы – у 1 (2,3%).Средний срок от начала заболевания до установки диагноза и началалечения составил 18,3±32,32 месяцев. На момент обследования средняядлительность ГПА в годах составляла 5,7±4,8 (в месяцах 69,6±57,7).У 22 из 60 больных у была выявлена локальная форма ГПА (поражениеверхних дыхательных путей, органа слуха и зрения). Локальная форма быладиагностирована у 7 мужчин и 15 женщин в возрасте от 18 до 70 лет(медиана по возрасту 47,5 лет).У 38 больных определялась генерализованная форма ГПА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
