Диссертация (1140128), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Дозу глюкокортикостероидов33постепенно снижали на протяжении 6 месяцев. Использование этанерцептане повлияло на частоту достижения длительной ремиссии у больных ГПА[71]Впоследниегодыбольшоевниманиеуделяетсяизучениюполиморфизму генов цитокинов у больных ГПА. В 2015 году опубликованырезультаты большого мета-анализа Jung и соавторов. В исследование быловключено 4121 пациент с васкулитом и 5504 здоровых добровольцев.Проводилось изучение влияния полиморфизма ИЛ-10 на развития васкулита.Авторы отметили, что у больных с гранулематозом с полиангиитом имеетсязависимость с наличием аллеля G ИЛ-10-1082.[72]1.5 Заключение:Исследованиепатогенетическойролицитокиноввразвитиигранулематоза с полиангиитом проводится уже длительное время.
Развитиелокального иммунного ответа при ГПА сопровождается повышением уровняИФН-γ (1й тип иммунного ответа)[14], однако при обострении заболеванияповышается экспрессия цитокинов, ответственных за развитие 2го типаиммунного ответа.[17,39] В нескольких работах отмечено, что уровень ИЛ-8достоверно коррелирует с активностью ГПА[40,41], а повышение уровня ИЛ18 и ИЛ-18-связывающего белка у больных с обострением ГПА позволяетпредположить, что данные маркеры играют определенную роль в патогенезеи течении болезни.[43] Применение стандартных схем лечения проявляетсвоиэффектыГПА.[70,71,72]путемизмененияцитокиновогоответаубольныхВ зарубежной литературе приводятся противоречивыеданные, касающиеся механизмов развития иммуновоспалительного процессаи методов оценки активности и распространенности ГПА.
[17,18,19]. Вотечественной практике проводились работы по изучению измененийуровней цитокинов у больных с AHЦА-ассоциированными васкулитами [36],однако определение дополнительных маркеров обострения и наличиягенерализованных форм ГПА, а также взаимосвязи органных поражений и34изменения уровней цитокинов не изучены. Исследование целого спектрацитокинов у больных ГПА позволит приблизиться к пониманию механизмовразвития иммуновоспалительного процесса, а также влияния цитокинов наформирование органных поражений при ГПА. [16] .35Глава 2. Материалы и методы исследованияВ исследование включали пациентов с ГПА, установленным всоответствии с критериями Американской коллегии ревматологов 1990 годаи номенклатурой, принятой в 2012 году на конференции в Чапел-Хилл(США).
[22] Все пациенты подписали информированное согласие участия висследовании, протокол которого был одобрен этическим комитетомФГАОУВО«ПервыйМосковскийгосударственныймедицинскийуниверситет им. И.М. Сеченова» (Сеченовский университет).Общее обследование больных проводилось по плану, принятому вклинике. При изучении анамнеза особое внимание уделяли наличиюактивности заболевания, наличию поражений различных органов и систем.Для оценки активности использовали шкалу BVAS (Бермингемский индексактивности васкулита). [73] Ремиссией заболевания считалось наличие 1 именее баллов по шкале BVAS, обострением ГПА - 2 и более баллов по шкалеBVAS. У всех больных проводилась оценка органных поражений сиспользованием индекса VDI. [74] При оценки индекса повреждения,учитываются повреждения органов, которые наблюдаются со временивозникновения васкулита.
У пациентов часто бывают сопутствующиезаболевания, возникшие до развития васкулита, которые не должныучитываться. Проявления активного васкулита регистрируются при помощишкалы BVAS.При анализе течения болезни выделяли локальный (поражение верхнихдыхательных путей, органа зрения и слуха) и генерализованный (поражениеверхних дыхательных путей, органа зрения и слуха в сочетании споражением легких и/или почек, а также желудочно-кишечного тракта,нервной системы, кожи) варианты ГПА. Генерализованный ГПА включает всебя ранний системный, генерализованный и тяжелый варианты заболевания,которые выделяют в соответствии с классификацией Европейского обществапо изучению васкулитов (EUVAS).[24, 75,76]36У всех больных оценивали наличие признаков васкулита и/илигранулематоза.
[77, 78, 79, 80] (таб. 3)Таблица 3Критерии васкулита и гранулематозного воспаления.Критерии васкулитаКритерии гранулематозного воспаления1. Гломерулонефрит1. Гранулематозное воспаление при биопсииГематурия или гематурия всочетании с протеинуриейГистологическая картинафокального сегментарногомалоиммунногогломерулонефрита сполулуниями2. Внепочечный васкулит:Кожный васкулит2. Инфильтраты/узлы в легких: стойкие(более 1 мес) с распадом, образованиемполостей и/или стенозирующий эндобронхитЭписклеритМножественный мононеврит3. Поражение ЛОР-органов или глаз:Перфорация носовой перегородкиДеструктивный синуситПодскладочный стеноз гортани или трахеиПсевдотумор орбитыПолиповидное утолщение слизистойпридаточных пазух носа, мастоидит(длительностью не менее 3 мес)372.1 Определение мРНК цитокинов в МПК методом ОТ-ПЦР.Определение мРНК цитокинов в МПК методом ОТ-ПЦР провели у 57из 60 клинически обследованных больных ГПА.
У 3х больных исследованиецитокинового профиля методом ОТ-ПЦР не проводилось. В качествеконтроляпроводилиисследованиеэкспрессиимРНКцитокиноввмононуклеарных клетках периферической крови 40 здоровых доноров.Метод проведения ОТ-ПЦР: 5 мл крови пациента собирали в пробиркус ЭДТА, тщательно перемешивали.
На 200 мкл фекола наслаивали кровь,центрифугировали 30 минут на 1500 оборотов в минуту. Через 30 минутснимали лейкоцитарное кольцо – средняя прослойка - и помещали вотдельнуюпробирку.Лейкоцитарнуювзвесьотмывалис180мклфизиологического раствора в центрифуге 2 раза по 10 минут на 1500оборотов в минуту. После второй промывки, физиологический растворсмывали, добавляли 300 мкл лизирующего раствора. Хранили при -20°С.РНК выделяли методом, предложенным P. Chomczynski и N.
Cacchi[81] с использованием наборадля выделения Научно-производственнойкомпании СИНТОЛ. Выделение РНК проводили согласно протоколу длявыделения тотальной РНК из образцов цельной крови.Обратная транскрипция и ПЦР-амплификация были выполнены всоответствии с методикой, предложенной С. Gelder. [82]Отбирали необходимое количество микропробирок объемом 0,2 (0,5)мл.
Приготавливали реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробиркус RT-mix вносили 5 мкл RT-G-mix-1 (RT-G-mix-2), тщательно перемешивалина вортексе, осаждали капли с крышки пробирки кратковременнымцентрифугированием. К полученному раствору добавляли 6 мкл ревертазы(MMlv), пипетировали 5 раз, перемешивали в вортексе. Далее осаждаликапли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием. Вносилив микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси.
Используя38наконечник с аэрозольным барьером, добавляли по 10 мкл РНК-пробы впробиркиспипетированием.реакционнойСтавилисмесью.пробиркивОсторожноамплификаторперемешивали(термостат)стемпературой 37°С на 30 минут. Полученную в реакции обратнойтранскрипции кДНК для последующей постановки ПЦР разводили в 2 разаДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным наконечником с аэрозольнымбарьером добавляли 20 мклДНК-буфера, аккуратно перемешивалипипетированием 10 раз). Готовый препарат кДНК хранить при температуре 20°С.Для проведения ПЦР использовались следущие праймеры: ИФН-α,ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8,ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-α.В пробирки, объемом 0,5-0,6 мкл.
закапывали 0,2 мкл праймера. Далееготовили реакционную смесь (Н2О 260 мкл + буфер + Mg 35 мкл + смесьДНТП 10-ти кратная 6,5 мкл + образец 34 мкл + полимераза 10,2 мкл). Затемперемешивали и добавляли в каждую пробирку по 23 мкл со своимпраймером. (делается всё на льду).
Далее ставили в амплификатор. ПЦРпроводили в объеме 25 мкл на программируемом амплификаторе «Терцик»производства АО «ДНК-технология», г. Москва (таб. 4,5).39Таблица 4Температурные циклы для амплификации950С1 мин1 Денатурация матричной ДНК941 мин2 Отжиг праймеровT от30 сек3 Синтез ДНК7230 секДостройка синтезированной ДНК727 мин10Хран.IIIIIIIVТаблица 5ИЛ-1βИЛ-2ИЛ-4ИЛ-6ИЛ-8ИЛ-10ИЛ-12ИЛ-18ФНО-αβ-актин0СИФН-γЦитокинИФН-αТемпература отжига праймеров50485050 4848585050506058ПослеамплификациипродуктыПЦРанализировалиэлектрофоретически в 1% агарозном геле.
В качестве позитивного контроляамплификации использовали β-актин. Электрофорез кДНК проводили в 1%агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в Трис-ацетатном буфере,содержащем 0,2 М ЭДТА. Электрофорез проводился в горизонтальныхкамерах фирмы «Bio-Rad» 20 минут. Для идентификации нуклеотидныхпоследовательностей использовали маркер для электрофореза фирмыPromega (G 1758).[83]40Фотографировали результаты на цифровую камеру Gel Imager-2(Хеликон) под мягким ультрафиолетовым освещением 360 нм.2.2 Определение содержания цитокинов в крови методомиммуноферментного анализа (ИФА)Содержание цитокинов в сыворотки крови больных ГПА определяли у40 больных.
Проводилось исследование ИНФ-α, ИЛ-8, ИЛ-18 , ИЛ-1β иФНО-α с использованем метода иммуноферментного анализа. Методикапроведения представлена ниже.2.2.1 Иммуноферментное определение концентрации ФНО-α всыворотке кровиДля количественного определения содержания ФНО-α использоваликоммерческие наборы для ИФА ЗАО «Вектор-Бест». Образцы кровисобирали во время визитов пациентов и сразу же замораживали при -40° C.Методопределенияоснованна«сэндвич»вариантетвердофазногоиммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональныхантител к ФНО- α.На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцыинкубировали2часаиммобилизированнымисвязывалсясвшейкерепри37Си700об/мин.сантителами.ИмеющийсявобразцахФНО-αиммобилизованнымиантителами.СвязавшийсяФНО-αвзаимодействовал при инкубации 1 час в шейкере при 37С и 700 об/мин.
сконъюгатом №1 (антитела к ФНО- α человека с биотином). На третьейстадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации 30 минпри 37С и 700 об/мин с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазойхрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветнойреакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекисиводородаихромогена-тетраметилбензидина,послеинкубациинапротяжении 25 мин при 18-25С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
