Диссертация (1140070), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Разработатьопределениюметодическийподходкморфофункциональногоиммуногистохимическомусостояниямитохондрийвскелетной поперечнополосатой мышечной ткани при миопатиях.2. Выявитьособенностииммуногистохимическихраспределениямаркеров:наружнойвыбранныхмитохондриальноймембраны и митохондриальных комплексов IV и V, а также маркеровфактора, индуцируемого гипоксией 1α (HIF-1α) и митохондриальногобелка теплового шока 70 (MTHSP70) при митохондриальных иврожденныхмиопатиях,атакжепрогрессирующихмышечныхдистрофиях.3.
Провести сравнительную морфометрическую оценку количественныхпараметров флуоресценции выбранных маркеров в мышечных волокнахв трех изученных группах больных.4. Определить информационную значимость исследованных показателейнаоснованиисопоставленияиммуногистохимическогоанализаполученныхсданнымирезультатовклиническогоибиохимического обследования больных исследованных групп.5. Определитьтактикувыбораиммуногистохимическихипоследовательностьфлуоресцентныхвыявлениямаркероввдифференциальной морфологической диагностике изученных нервномышечных заболеваний.Анализлитературыобосновалактуальностьцелииадекватностьпоставленных нами задач.
Так, в настоящее время появляется все большедоказательствмитохондриальныхизмененийкаксобственнопримитохондриальных миопатиях, так и при других нервно-мышечных заболеваниях:миопатии центрального стержня [Jungbluthмиопатии [Bevilacqa J.A.H. et.al., 2012], центральноядернойet.al., 2009], немалиновой миопатии [Dubowitz et.al.,2013], мышечной дистрофии Дюшенна [PercivalJ.M.,et.al., 2013] и др. При этом,экспериментальные данные доказывают важную роль белков HIF-1α и MTHSP70в регуляции функции митохондрий: так, установлена связь между дисфункцией155митохондрий и активацией фактора HIF-1α [ZhaoL,et.al., 2014]; в исследованииKilgore et al.
[Kilgore et al., 1996] было обнаружено снижение количестваMTHSP70 в зонах миокарда, пограничных с зоной инфаркта: потеря MTHSP70 вданных зонах, как предполагается, может привести к уменьшению количествафункциональноактивныхмитохондрий.Кромеэтого,MTHSP70играетзначительную роль в созревании субъединицы 1 митохондриального комплексаIV (Cox1), кодируемой непосредственно митохондриальной ДНК [BöttingerL.et.al., 2013].В ряде исследований показана эффективность использования антител ксубъединицам митохондриального комплекса IV, кодируемым мтДНК, придиагностике недостаточности COX [Kollberg G. et al.
2005; Mahad D. et.al., 2008;TanjiK.,BonillaE.,2008].Такжебыларазработанаметодикаиммуногистохимического анализа системы OXPHOS в тканях больных сподозрением на митохондриальные заболевания [DePaepeB.etal.2009a],преимущество которой состоит в возможности использования как замороженных,так и парафиновых срезов скелетной мышечной ткани. Особый акцент авторыэтой методики делают на ее потенциал в вопросах дифференциальнойдиагностики мутаций ядерной и митохондриальной ДНК.Таким образом, морфофункциональное состояние митохондрий в скелетнойпоперечнополосатой мышечной ткани при различных наследственных нервномышечных заболеваниях требует внимательного изучения, а также разработкиновых методических подходов к этому исследованию.
В этом отношениипредставляется перспективным использование методических возможностейфлуоресцентной иммуногистохимии на материале мышечных биопсий.Материалом настоящего исследования являлся биопсийный материалскелетной поперечнополосатой мышечной ткани передней группы мышц бедра,взятый с диагностической целью у 93 пациентов с различными нервномышечными заболеваниями: у 31 пациента в возрасте от 2 до 17 лет с диагнозоммитохондриальная миопатия; у 4 пациентов в возрасте от 9 до 13 лет с диагнозомврожденная миопатия центрального стержня; у 5 пациентов в возрасте от 3 до 14156лет с диагнозом врожденная многостержневая миопатия; у 6 пациентов в возрастеот 2 до 5 лет с диагнозом врожденная немалиновая миопатия; у 9 пациентов ввозрасте от 2 до 14 лет с диагнозом врожденная саркотубулярная миопатия; у 8пациентов в возрасте от 2 до 14 лет с диагнозом врожденная центральноядернаямиопатия; у 10 пациентов в возрасте от 1 года до 13 лет с диагнозом врожденнаямышечная дистрофия; у 20 пациентов в возрасте от 2 до 12 лет с диагнозомпрогрессирующая мышечная дистрофия.Длярешенияпоставленныхнамизадачбылипроведены:анализклинических показателей (степень тяжести заболевания, мышечная сила,утомляемость) при помощи соответствующих шкал; биохимические анализыопределения уровней молочной и пировиноградной кислот, КФК и ЛДГ;гистоферментохимическийметодопределенияактивностиСДГ;методфлуоресцентной иммуногистохимии с антителами к наружной митохондриальноймембране, митохондриальным комплексам IV и V, регуляторным белкам HIF-1α иMTHSP70 в мышечных волокнах I типа.
Для анализа и оценки полученныхданныхприменялистандартныеметодыописательнойстатистики:вычисление средних значений и их ошибок. Для анализа связи между двумяпризнаками применялся метод ранговой корреляции Спирмена и дисперсионногорангового анализа ANOVA on Ranks. Различия считались достоверными прир<0,05. Для обработки данных был использован язык программирования "R".Анализ полученных данных показал, что при митохондриальныхмиопатиях более чем в половине (60%) мышечных волокон были обнаруженымитохондриальныескопления.Приэтомбиоптатыскелетныхпоперечнополосатых мышц пациентов с отсроченным дебютом заболеванияхарактеризовались повышенным количеством митохондрий, что, с однойстороны, может отражать прогрессирование митохондриального заболевания свозрастом, а с другой, указывает на некоторую компенсацию патологическогопроцесса за счет небольшого количества сохранных митохондрий.
Однакозначительный объем митохондриального пула не обеспечивает адекватнуюутилизацию пирувата как натощак, так и после углеводной нагрузки.157Морфометрическиепоказателиплощади,занимаемоймаркерамимитохондриальных белков (маркеры НММ, митохондриальных комплексов IV иV), при митохондриальных миопатиях были наиболее выраженными среди всехисследованных нами групп. При этом отмечалась наибольшая средняя яркостьмитохондриального комплекса V среди исследованных нами групп. Однако,большинство обнаруженных митохондриальных скоплений характеризовалосьнескоординированной экспрессией митохондриальных комплексов IV и V, чтоуказывает на преобладание патологически измененных органелл в мышечнойткани больных данной группы.
Отсутствие достоверных взаимосвязей междуактивностью митохондриальных комплексов IV и V и постнагрузочнымипоказателями лактата и пирувата может свидетельствовать об относительнойдесинхронизации метаболического процесса, при которой утилизация глюкозыпроисходит независимо от функционального состояния дыхательной цепи исинтеза АТФ.Вскелетнойпоперечнополосатоймышечнойтканибольныхсмитохондриальными миопатиями отмечалось наличие участков интенсивнойфлуоресценции маркера HIF-1α при отсутствии в этих зонах интенсивногосвечения маркера НММ (то есть вне митохондриальных скоплений), а такжеучастки колокализации маркеров HIF-1α и НММ.
Средняя яркость маркера HIF1α характеризовалась наибольшей интенсивностью в группе митохондриальныхбольных, в то время как флуоресценция другого регуляторного белка - MTHSP70была низкой относительно других групп, кроме того было показано, что по мерепрогрессирования митохондриальной миопатии активность белка MTHSP70 вмышечной ткани падает.
Флуоресценция белка MTHSP70 определялась в зонах снизкимиморфометрическимипоказателямимаркеровисследуемыхмитохондриальных белков и фактора HIF-1α. При этом, базовые показателиметаболизма лактата и пирувата в крови пациентов обратно коррелировали сактивностью белка MTHSP70, что свидетельствует о компенсаторной роливысокой активности этого белка при митохондриальной недостаточности даже убольных обсуждаемой группы.158Обнаруженные нами прямые корреляции показателя КФК с площадью,занимаемой маркером HIF-1α, а также с интегральной яркостью данного маркерамогут объясняться аутоиммунной деструкцией мышечных волокон, приводящейтакже к гибели в них митохондрий, для компенсации которой, по нашемумнению, активируется HIF-1α-опосредованный механизм митохондриальногобиогенеза.Таким образом следует отметить, что при митохондриальных миопатияхморфометрическаяоценкаколичественныхпараметровфлуоресценциивышеуказанных маркеров в мышечных волокнах I типа выявила значительноепреобладание площади, занимаемой маркерами митохондриальных белков(маркерынаружноймитохондриальноймембраны,митохондриальныхкомплексов IV и V), однако при этом было обнаружено нарушение профиляраспределения флуоресцентных маркеров исследованных белков, с наибольшейсредней яркость маркера митохондриального комплекса V среди исследованныхгрупп.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
