Диссертация (1139886), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Существуютразные технологии обработки спермы: однократная или двойная простаяотмывка сперматозоидов от семенной плазмы, фильтрационные методы,методы с использованием миграции сперматозоидов и центрифугирование вградиенте плотности. Из них простая отмывка сперматозоидов в силу низкойэффективности, а фильтрационные методы – технической сложности длялечениямужскогобесплодия,обусловленногофрагментациейДНКсперматозоидов, практически не применяются. Поэтому на современномэтапе с этой целью используют только два последних методах обработкиспермы [90; 114; 133; 157; 216].Средиметодовсиспользованиемсамостоятельноймиграциисперматозоидов наиболее распространены так называемые методы флотации,суть которых состоит в том, что создаются условия для флотациисперматозоидов и попадания во фракцию культуральной среды, т.е.имитируется миграция компетентных сперматозоидов через цервикальнуюслизь in vivo.
Образец спермы помещается под фракцией культуральнойсреды, что создает условия для миграции сперматозоидов из семеннойплазмы в среду. При этом почти полностью исключается попадание в этусреду других клеток или их фрагментов, в том числе и сперматозоидов сфрагментированной ДНК. После флотации верхняя часть вышележащегослоя культуральной среды, содержащая подвижные клетки, извлекается ицентрифугируется.Полученныйосадокповторносуспендируетсявкультуральной среде. Данная методика позволяет получить образцы спермыхорошегокачества,сперматозоидовснотребуетпоступательнымналичиядостаточногодвижением.Методыколичествафлотации30различаются по типу, объему и способу получения вышележащего слоякультуральной среды, зоне контакта, продолжительности и температуреинкубации. Наиболее часто из методов флотации используется процедура«swim-up» [67; 133; 170; 184].Достаточно эффективным методом обработки образцов низкогокачества является центрифугирование спермы в двух- или трехслойномградиенте плотности.
Этот метод основан на принципе центрифугированияспермы через градиент, образованный, по меньшей мере, двумя слоямирастворов с различной плотностью. Градиент образуется между слоямивзвесей (содержащих различные концентрации частиц коллоидного кремния,покрытых силаном) и разделяет клетки по их плотности. Взвесь большейплотности помещается на дно пробирки, а сверху наслаивается взвесьменьшей плотности. Фракцию спермы аккуратно помещают поверхградиента. Сперматозоиды, плотность которых ниже, чем плотность взвеси,неспособны проникнуть через эту взвесь и удерживаются в пограничномучастке между слоями. Центрифугирование в градиенте приводит кперераспределениюсперматозоидовидругихкомпонентов-онинакапливаются в той или иной взвеси или в пограничной области междувзвесями с различной плотностью.
Сперматозоиды, получаемые со днапробирки, обладают высокой подвижностью и представляют собой лучшуюфракцию для оплодотворения. Неподвижные, погибшие или поврежденныесперматозоиды, а также другие клетки остаются во фракции с низкойплотностью или в пограничном участке между слоями с различнойплотностью. Метод градиента плотности применяется для обработки спермыкак хорошего, так и низкого качества. При этой методике могут бытьиспользованы взвеси различной плотности и разное количество слоев.Обычно на практике применяется двойной градиент 90% и 45% или 80% и40%.
Долгое время использовали градиент «Percoll» («Kabi Pharmacia»,Швеция) однако из-за содержания в нем большого количества эндотоксиновон был заменен другими градиентами, более подходящими для обработки31спермы человека. В настоящее время в числе основных градиентов могутбыть названы такие, как «PureSperm» («Nidacon International», Швеция),«SpermGrad» («Vitrolife», Швеция), «PureCeption» («Cooper Surgical», США),«Isolate» («Irvine Scientific», США), «Sil-Select Plus» («Fertipro», Бельгия),«OptiPrep» («Axis-Shield», Норвегия) [68; 78; 90; 157].Общим недостатком всех методов обработки спермы служит тообстоятельство, что при этих процедурах вследствие удаления семеннойплазмы, обладающей антиоксидантными свойствами, центрифугирования идлительной инкубации возможно дополнительное образование АФК сусугублением повреждений ДНК сперматозоидов [164].
В литературепредставлены противоречивые данные о возможностях методов обработкиспермы по преодолению фрагментации ДНК сперматозоидов. Многиеисследования показали, что их применение позволяет снизить степеньфрагментации ДНК сперматозоидов [99; 117; 170; 184; 197]. К примеру, поданным Z.H. Niu et al.
[170], в выборке из 256 мужчин отмечено достоверноеуменьшение среднего значения индекса фрагментации с 14,3±11,2% до4,9±3,1% после «swim-up». Но в ряде других исследований, наоборот, былиполучены данные об отсутствии эффекта или ухудшении показателейфрагментации ДНК сперматозоидов после использования таких процедур[111; 215; 222; 242].Кроме того, результаты сравнительных исследований различныхметодов обработки спермы также имеют противоречивый характер. Так, помнению I. Natali [167], после процедуры «swim-up» степень поврежденияДНК сперматозоидов была ниже, чем после метода центрифугирования вградиенте плотности.
В противоположность этому, I. Amiri et al. [67]сообщили о меньшей степени фрагментации ДНК сперматозоидов послецентрифугирования в градиенте плотности по сравнению с процедурой«swim-up» - индекс фрагментации по методу ДНК-комет составил23,51±6,83% и 32,33±12% соответственно (p<0,0001). К отличным от нихвыводам пришли V. Jayaraman et al. [133], исследовавшие с помощью TUNEL32влияниеразличныхметодовобработкиспермы(«swim-up»,центрифугирование в градиенте плотности и комбинации этих методов) настепеньфрагментацииДНКсперматозоидовпритрехвариантахспермограммы – нормозооспермии, олигозооспермии и тератозооспермии.Оказалось, что после всех способов обработки спермы происходитдостоверное снижение процента TUNEL-позитивных клеток при всех формахспермограммы, однако статистически значимой разницы между методамиобработки спермы по этому показателю не выявлено независимо от картиныспермограммы.
Результаты работы X.D. Zhang et al. [236] также подтвердилиотсутствие существенной разницы между «swim-up» и центрифугированиемв градиенте плотности по мере влияния на степень фрагментации ДНКсперматозоидов.ДостаточнофрагментацииэффективнымДНКметодомлечениясперматозоидоввысокогосчитаетсяуровняиспользованиерекомбинантных препаратов ФСГ (фолликулостимулирующего гормона):фоллитропина-альфаифоллитропина-бета.Механизмдействияэтихпрепаратов, вероятно, заключается в том, что под их воздействиемувеличивается число созревающих в семенных канальцах сперматозоидов, ачисло сперматозоидов с фрагментацией ДНК в ходе апоптоза остаетсянеизменной.ТемсперматозоидовссамымдостигаетсяфрагментациейДНКуменьшениесредиобъемнойобщегодоликоличествасперматозоидов [179]. В одной из экспериментальных работ была показанароль рецепции рекомбинантного ФСГ в обеспечении нормальной структурыДНК: фрагментация ДНК эпидидимальных сперматозоидов у мышей былазначительно меньше, чем у животных с «нокаутом» рецептора ФСГ [151].КлиническаяэффективностьФСГотмеченависследованииИ.В.Виноградова и соавт.
[13], показавшем, что комбинация рекомбинантногоФСГ (фоллитропина-бета)и оральных антиоксидантов приводит кзначительному снижению уровня фрагментации ДНК у 12 из 18 человек,незначительному снижению уровня – у 5 человек и повышению уровня –33лишь у 1 человека. Другим примером служит работ N. Colacurci et al. [94],которая выявила достоверное уменьшение индекса фрагментации ДНК сбазового23,7±9,4%до12,6±7,0%после3-месячногоприменениярекомбинантного ФСГ, тогда как в контрольной группе эти показателисоставляли22,3±9,3%и23,9±10,2%соответственно.Однакодляокончательного заключения об эффективности и целесообразности широкогоприменения данного подхода в лечении фрагментации ДНК сперматозоидовнеобходимо продолжение масштабных исследований [13; 151; 179].К патогенетически обоснованному лечению фрагментации ДНКсперматозоидов относится применение антиоксидантов, так как онипозволяют снизить концентрацию и, следовательно, минимизироватьнегативное воздействие свободных радикалов в сперме.
Антиоксидантнаятерапия приводит к улучшению целостности ДНК сперматозоидов, болееадекватному соотношению разных типов протамина и уменьшениювыраженности апоптоза гамет, следствием которых в итоге может статьснижение уровня фрагментации ДНК с соответствующим повышениемфертильного потенциала мужчин [113; 159; 223; 239]. Было предложеномножество препаратов для антиоксидантной терапии, например: витамины Cи E, L- и ацетил-L- карнитин, цинк, селен, глутатион, β-каротин, фолиеваякислота, астаксантин, N-ацетил-L-цистеин, D-аспартат, коэнзим Q10,пентоксифиллин и др. [31; 47; 53; 56; 113; 123; 127; 154; 204; 218; 239]. Вцелом, был отмечен положительный эффект антиоксидантной терапии дляуменьшения степени фрагментации ДНК сперматозоидов.
Тем не менее, досих пор не установлен точный механизм действия антиоксидантов иотсутствуют единые подходы к назначению данной терапии. Кроме того,большинствоклиническихисследованийэтогорядаоснованонамалочисленных выборках пациентов без включения контрольных групп, атакже лишь в нескольких работах предполагалось изучение влиянияантиоксидантной терапии на наступление беременности. С учетом этогоможно констатировать, что делать окончательные выводы относительно34эффективностиэтогометодапопреодолениюфрагментацииДНКсперматозоидов преждевременно, и для более глубокого пониманияпоследствийразличныхантиоксидантовнеобходимопроведениекрупныхнафертильностьмногоцентровыхмужчиныдвойныхслепыхрандомизированных исследований [113; 154; 204; 239].В недавнем исследовании А.Ю.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
