Диссертация (1139701), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Размером 50x50 мкм с разрешением 512x512точек в режимах отображения высоты скана для визуализации морфологииповерхности, а также в режиме фазового контраста – для отображенияраспределения сил трения между зондом и образцом по поверхности.Далее, в соединительной ткани невральных оболочек, в том числе ипараневрии, была проведена количественно-качественная оценка клеточногокомпонента.Поцито-икариологическимпризнакамвсоединительнотканных оболочках периферических нервов были выделеныследующие типы клеток (рисунок 11): фибробласты (А) – самыераспространенные клетки соединительной ткани, имеют очень крупнуюрезко базофильную цитоплазму с выростами неправильной формы.
В центреклетки располагается овальное, светлое, слабо базофильное ядро сэксцентричным, темно базофильным крупным ядрышком; фиброциты (Б) –по размерам значительно меньше, чем фибробласт, имеют веретеновиднуюформу. Мелкое, темное ядро палочковидной формы, цитоплазма светлая,ацидофильная; плазмоциты (В) – крупные овальные клетки с базофильнойцитоплазмой. Сферическое ядро расположено эксцентрично, в кариоплазмекоторого, компактный гетерохроматин в виде крупных глыбок чередуется сосветлыми участками примерно одинаковых размеров, напоминая поконфигурациициферблатчасов.Околоокрашенный участок, так называемый -ядрарасполагаетсябледно«светлый дворик», местолокализации комплекса Гольджи и центриоли; макрофаги (Г) – клеткикрупных размеров, цитоплазма, образующая значительное количествоотростков, содержит хорошо различимые лизосомы и расположенноеэксцентрично, ядро, неправильной формы; тучные клетки (рисунок 12) –овальной, округлой или прямоугольной (в условиях «гипокинезии») формы.Цитоплазма заполнена базофильными секреторными гранулами, которые68часто маскируют мелкое сферическое ядро, расположенное в центре клетки[5, 132, 164, 194, 208, 321, 329].
Количественную оценку клеточного составапроводили в расчете на 100 клеток, не менее чем в 10 полях зрения.ФбФцРисунокМф11–ПЛТипыклетокМЭНсоединительнотканныхоболочекпериферических нервов сгибателей и нерва разгибателей: Фб- фибробласты,Фц – фиброциты, Мф-макрофаги, Н-нейтрофилы, Э-эозинофилы, Ллимфоциты, Мц-моноциты, ТК-тучные клетки, П-плазмоциты (схема).Дляобъективизацииформированиязаключенияоклеточнойсоставляющей соединительнотканных оболочек периферических нервов,вычисляли соотношение клеток-резидентов (фибробласты, фиброциты имакрофаги) к клеткам-нерезидентам (гранулоциты, агранулоциты, тучныеклетки и плазмоциты) и получали, условно обозначенный, клеточный индекспо следующей формуле:КИ =где Фб- фибробласты, Фц – фиброциты,Мф-макрофаги, Н-нейтрофилы,Э-эозинофилы, Л-лимфоциты,Мц-моноциты, ТК-тучные клетки,П-плазмоциты.В зависимости от количества цитоплазматических гранул и, какследствие, интенсивности фонового окрашивания клетки, а так же, учитываяклассификацию Д.П.
Линдера, 1976, 1980 [100, 101] и способ оценки тучныхклеток Г.В. Порядина [148] , было выделено четыре типа тучных клеток69(рисунок 12). Клетки 0-типа – очень темные, плотно заполнены интенсивноокрашенными гранулами, отдельные гранулы и ядро не различимы; I-тип –темные клетки, с хорошо различимым ядром и отдельными гранулами вцитоплазме; II-тип – светлые клетки, рыхло заполнены хорошо видимымигранулами, менее интенсивно окрашенными и с отчетливо различимымядром; III-тип – светлые клетки, с небольшим количеством окрашенныхгранул в цитоплазме, с признаками нарушения целостности клеточноймембраны и выделения в окружающее пространство цитоплазматическихгранул. Рассчитывали индекс дегрануляции (ИД) или отношение количествадегранулированных клеток к общему количеству анализированных клеток поформуле:где I,II,III – номер типа тучных клеток,Х0, Х1, Х2, Х3 – количество тучных клеток каждого типа [26, 119, 124,243, 260, 274, 293, 303, 320, 325].0-типI-тип0-типII-типI-типIII -типII-типIII-типРисунок 12 – Типы тучных клеток по Линдеру Д.П.
(схема).Для количественной оценки площади, занимаемой тучными клетками,находящимисявстадиинакоплениясекрета,средивсехсоединительнотканных клеток эпи- и параневральной соединительной ткани,нацифровыхизображенияхтотальныхпрепаратоввторойсерииисследования, был разработан и применен способ, позволяющий оценитьданный показатель и стандартизировать процесс морфометрического анализа(получен приоритетный номер на изобретение - №2015126128/08(040593) от7030.06.2015г. «Способ анализа цифровых изображений гистологическихпрепаратов»).Во второй серии исследований данной работы был использованиммуногистохимический метод, для оценки степени пролиферативнойактивностиклетокэпи-ипараневральнойсоединительнойтканипериферических нервов при различной степени двигательной активностигруднойконечностивэкспериментальносозданныхусловиях(«гипокинезии» и «гиперкинезии»).Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии состандартными протоколами системы визуализации Ultra-Vision ONE.Использовали моноклональные антитела к маркеру клеточной пролиферацииKi-67 (ядерный антиген), который позволяет выделить клетки, находящиеся вактивной фазе клеточного цикла (G1, S, G2 и М-фазы), ядра клеток,находящиеся в фазе покоя G0 не окрашиваются.
Индекс Ki-67 вычисляли каксоотношение количества специфически окрашенных ядер к общемуколичеству всех ядер (не менее чем в 10 полях зрения) и выражали впроцентах [9, 92, 241, 262, 276, 280, 311].Для проведения иммуногистохимического исследования изготавливалипоперечные парафиновые срезы толщиной 5-6 мкм, располагали их напредметные стекла (Super Frost Plus), предварительно обработанные поли-Lлизином и высушивали в течение 12 часов при t=37º С. Затемрегидратировали и осуществляли демаскировку антигенов кипячениемобразцов в 0,01 М цитратном буфере (рН 6.0) на водяной бане. Дляинактивации эндогенной пероксидазы, на срезы наносили 1-3% раствор Н2О2в течение 10 мин.
Инкубацию с первичными кроличьими антителами Ki-67(М3060, SP6, 1:200, «Dako») проводили при комнатной температуре, втечение часа. Визуализацию результатов после иммуногистохимическойреакции с моноклональнымикроличьими антителами осуществляли спомощью непрямого стрептавидин-биотинового пероксидазного метода(«Dako», LSAB+Kit, HRP), в качестве хромогенного субстрата был71использован раствор диаминобензидина («Dako», Liquid DAB+). С цельювизуализации всех клеток соединительной ткани докрашивали ядрагематоксилином.
В качестве негативного контроля использовали образцы снанесением вторичных антител без нанесения первичных.Так же, для исключения незначительных отклонений в ходеиммуногистохимической реакции были учтены - температура воздуха влаборатории, все этапы выполнялись одномоментно, использовались одни ите же буферные растворы, инкубационные смеси и растворы антител.
Всевременные промежутки были одинаковыми [66, 144, 179, 250]. Учетрезультатов проводили при микроскопии х400 крат. Регистрировали клетки,осуществляющие экспрессию белка Ki-67. Подсчет количества Ki-67позитивных клеток проводили на 100 клеток при анализе не менее 10 полейзрения. Затем вычисляли индекс пролиферативной активности (ИП) поформуле:ИПгде ИП – индекс пролиферации,KI-67+ - количество клеток экспрессирующих белок Ki-67,ОКК – общее количество клеток.Статистическую обработку всех полученных цифровых данныхвыполняли в соответствии с современными представлениями о правилахматематической обработки данных медицинских исследований [93, 96, 97,152].Вседанныебылипроверенынасоответствиенормальномураспределению всех исследуемых параметров при помощи построениягистограмм с наложением нормальной кривой и нормальных вероятностныхграфиков и одновыборочных тестов, согласно стандартным статистическимпакетам.Учитывая допустимый для экспериментальных медико- биологическихисследований уровень р≤0,05, для подтверждения статистической гипотезыбыл выбран именно такой уровень значимости.
Для описания выборочной72совокупности данных использовали средние значения со стандартнойошибкой средних показателей или стандартным отклонением (M±m(σ)). Длявыявления значимой корреляционной связи между количественнымипараметрами применяли корреляционный анализ. Степень сопряженностипризнаковопределялиметодомпарнойкорреляциисвычислениемкоэффициента корреляции (r).
Для переменных величин Х и Y слабойсчитали корреляцию при модульном значении r<0,3, при r=0,3-0,7интенсивность связи признавали средней, при r˃0,7 связь расценивали каксильную [50].Так же, в данной работе были использованы методы математическогомоделирования и корреляционного анализа с целью создания моделипараневрия в эволюционном ряду и прогнозирования возможной роли этогосоединительнотканногоаппаратаприневрологическихзаболеваниях,нейрохирургических манипуляциях и физиотерапевтических процедурах [70,86, 97, 136, 141, 142, 153, 180]. В частности, в результате проведенногоисследования на основе уравнений экспоненциальной регрессии былиразработаны регрессионные модели зависимости площади поперечногосечения сосудисто-нервного пучка (SСNP) и площади окружающейсоединительной ткани (SCTK) от систематического положения позвоночногоживотного в филогенетическом ряду.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
