Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 95
Текст из файла (страница 95)
Гомологичная рекомбинация служит множеству целей в клетке, но три направления действия имеют первостепенное значение. Наиболее распространенное ее применение состоит в точном устранении двухцепочечных разрывов, с которым мы ознакомились в предыдущем параграфе (рис. 5.51, б). Хотя двухцепочечные разрывы могут образоваться в результате действия радиации и химически активных веществ, многие представляют собой продукты застопорива. ния или разрушения репликационных вилок ДНК.
Это применение гомологичной рекомбинации существенно для каждой пролиферирующей клетки, потому что аварии происходят почти при каждом цикле репликации ДНК. Самые разные события могут повлечь за собой поломку репликационной вилки в ходе процесса репликации. Рассмотрим только один пример: однонитевой разрыв или брешь в родительской спирали ДНК сразу перед репликационной вилкой. Когда вилка достигает этого повреждения, она разваливается и дает одну разорванную и одну интактную дочерние хромосомы. Однако ряд реакций рекомбинации, который может начинаться с процесса внедрения (вторжения) иепи, или инвазии (зггапд шоаз(оп), и запускать синтез ДНК ДНК-полимеразой, может безупречно восстановить разорванную хромосому (рнс.
5.53). 468 Честь 2. Основные генетические механизмы знаем о биохимии генетической рекомбинации, была изначально получена в ходе исследования бактерии Е. со1ю' и поражающих ее вирусов. Затем эксперименты проводили на простых эукариотах типа дрожжей. При работе с такими организмами, обладающими коротким временем смены поколений и относительно маленькими геномами, появилась возможность получать большой набор мутантов с дефектами в процессах рекомбинации. Затем в каждом мутанте идентифицировали видоизмененный белок и в конечном счете изучили его биохимические свойства. Позже близких родственников этих белков обнаружили и детально охарактеризовали у дрозофилы, мышей и человека.
Эти исследования показывают, что фундаментальные процессы, которые катализируют гомологичную рекомбинацию, являются общими для всех клеток, о чем мы сейчас и поговорим. 5.5.3. Гомологичная рекомбинация направляется комплементарными взаимодействиями между основаниями двух гомологичных ДНК-дуплексов Отличительный признак гомологичной рекомбинации — то, что она происходит только между двухцепочечными ДНК, которые имеют обширные области подобия (гомологии) последовательностей. Неудивительно, что в основе этого требования лежит спаривание оснований; и два дуплекса (так называют двухцепочечные молекулы ДНК) ДНК, которые претерпевают гомологичную рекомбинацию, проверяют последовательности ДНК друг у друга, вовлекая в спаривание на протяженных участках основания одной из нитей одного дуплекса ДНК и основания компле ментарной ей нити из другого дуплекса.
Для успешного протекания гомологичной рекомбинации соответствие не обязательно должно быть полным, но должно, по крайней мере, быть очень близким. В своей простейшей форме спаривания оснований такого типа может быть сымитировано в пробирке — когда двойной спирали ДНК предоставляют возможность образоваться вновь из предварительно разделенных одиночных цепей. Этот процесс, названный ренатурацией ДНК (гепагигаиоп), илн гибридизацией (ЬуЬг1йга6оп), происходит в том случае, если в результате редкого случайного столкновения совместятся комплементарные последовательности нуклеотидов в двух соответствующих друг другу одинарных цепях ДНК и в силу этого между ними сформируется короткий отрезок двойной спирали. Этот относительно медленный шаг зарождения спирали сопровождается очень быстрым шагом «застегивания молнии», когда область двойной спирали распространяется, чтобы максимально увеличить число спаренных оснований (рис.
5.54). Для образования новой двойной спирали таким способом необходимо, чтобы отжигаемые (гибридизующиеся) нити находились в открытой, развернутой конформации. По этой причине реакции гибридизации гв п11го выполняют или при высокой температуре, или в присутствии органического растворителя типа формамида; в таких условиях «расплавляюгся» короткие шпилечные спирали, которые образуются в результате взаимодействий между комплементарными основаниями в пределах одной цепи, что приводит к замыканию цепи на себя. Большинство клеток не может пережить такие жесткие условия и, вместо этого, использует белки, связывающие одноцепочечную ДНК (см. стр. 419) для разрушения шпилечных спиралей.
Белки, связывающие одноцепочечную ДНК, важны для репликации ДНК (как описано ранее), а также для гомологичной рекомбинации; они связываются сильно и коопера- гггв ,/ БЫСТРОЕ в зАстЕГивАние МОЛНИИ» с НУКЛЕАЦИЯ СПИРАЛИ Е Рис. 5 54. ГибридизвцияДНК.Двойные спирали ДНК формируются повторно из отдельных цепей в ходе реакции, кото рея зависит от случайного столкновения двух ком пле менте рных цепей ДН К.
Подавляющее большинство таких столкновений не будет продуктивным, квк зто показано слева, но некоторые, хотя и немногочисленные, дают короткую область, в которой сформировались комплементврные пары оснований 1зврождение, или нуклевция, спирали). Затем быстрое «звстегиввние» ведет к формированию полной двойной спирали, Таким вот методом «проб и ошибок» цепь ДНК находит себе комплементе рното партнера даже среди миллионов несоответствующих ей цепей ДНК. тивно с сахарофосфатным остовом всех одноцепочечных областей ДН К и удерживают их в растянутой конформации с выставленными наружу основаниями (см.
рис. 5.16 и 5.17). В такой растянутой конформации одинарная нить ДНК может эффектив но взаимодействовать либо с комплементарными основаниями, либо с молекулами нуклеозидтрифосфата (при репликации ДНК), либо с комплементарным отрезком другой одинарной цепи ДНК (как часть процесса генетической рекомбинации). В результате гибридизации ДНК создается область спирали, образованная цепями, которые происходят от двух разных молекул ДНК. Формирование такой области, известной как гепгеродуилекс, является важным этапом в любом процессе гомологичной рекомбинации. Поскольку львиная доля ДНК в клетке двухцепочеч ная, «пробирочная» модель гибридизации ДНК не может в полной мере обьяснить, как этот процесс происходит в клетке.
Действительно, для запуска гомологичной рекомбинации между двумя двухцепочечными молекулами ДНК с подобными последовательностями нуклеотидов необходимы специальные механизмы. Край не важными участниками этих механизмов являются белки, которые позволяют осуществлять гнбридизацию ДНК в клетке посредством внедрения цепи (инвазии Кепи) — спаривания участка одноцепочечной ДНК с комплементарной цепью в другой двойной спирали ДНК, — как мы опишем далее.
5.5.4. Белок Яесй и его гомологи способствуют спариванию одинарной цепи ДНК с гомологичной областью двойной спирали ДНК Поскольку широкомасштабные комнлементарные взаимодействия пар осно наний не могут произойти между двумя неповрежденными двойными спиралями ДНК, гибридизация ДНК, которая является критически важной для гомологичной рекомбинации, может начаться только после того, как цепь ДНК из одной спира 47О -:: ЧВЕП' ХОСй(ЗВНЗВД« РВЗ)ВТЕ)ЗВМВВВВ(В)(йзйВМ ли освободится от спаривания с комплементарной ей нитью и, таким образом, ее нуклеотиды станут доступными для комплеме>ггарного взаимодействия со второй спиралью ДНК.
В примере, который бьщ ранее представлен на рис. 5.53. такая свободная одинарная нить образуется, когда репликационная вилка упирается в раз рыв на ДНК, разваливаегся (создавая новый двунитевой конец), и экзонуклеаза деградирует 5'-конец разрыва, оставляя неспаренньвч его Зсконец. В других при ложениях гомологичной рекомбинации однонитевые области создаются подобными этому способами, о чем мы поговорим позже. На одинарную цепь на 3' конце ДНК воздействует несколько специализиро ванных белков, которые направляют ее инвазию в дуплекс гомологичной ДНК. Первым по важности идет белок ВесА (его название у Е.
сой) и его гомолог Вад51 (его название в организмах практически всех эукариот) (рнс. 5.55). Подобно белку, связывающему одноцепочечную ДНК, белок КесА связывается с одноцепочечной ДНК прочно в виде протяженных кооперативных кластеров, образуя таким образом нуклеопротеиновый филамент.
Поскольку каждый мономер ВесА имеет более одного участка связывания с ДНК, то нить из белков ВесА может удерживать одноцепо чечную ДНК и двойную спираль ДНК вместе (рис. 5.56). Такое взаимное располо жение позволяет белку ВесА катализировать многоступенчатую реакцию синапсиса ДНК, которая происходит между двойной спиралью ДНК и гомологичной областью однонитевой ДНК. На первом этапе белок ВесА переплетает однотяжевую ДНК с дуплексом ДНК независимым от последовательности образом. Затем одинарная нить ДНК «ищет» в дуплексе гомологичные последовательности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
