Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 100
Текст из файла (страница 100)
Консервативная сайт-специфическая рекомбинации может бьгть использована для включения и выключения генов Когда участки, специфично узнаваемые ферментом консервативной сайт.сцецифической рекомбинации, инвертируются в своей ориентации, последовательность " Встраивания. - Прил. перев.
' Зксцизнонная гмзролазз; вырезает сегменты ДИК нз хромосом. Прим. лед. ДНК между ними инвертируется, а не вырезается (см. рис. 5.7б). Многие бактерии используют такую инверсию последовательности ДНК для регуляции экспрессии определенных генов — например, при сборке активного гена из разделенных кодирую щих участков. Преимущество регугищии такого типа состоит в том, что она наследуется напрямую, так как новое «устроение» ДНК автоматически передастся дочерним хро мосомам при делении клетки.
Мы встретим характерный пример такого использования консервативной сайт-специфической рекомбинации в главе 7 (см. рис. 7.б4). бактвриапьная клетка х)юмосома кпвтки-хозяина лямбда К ПРИКРЕПЛЕНИЕ К КЛЕТКЕ И ВВЕДЕНИЕ В НЕЕ ДНК ОБРАЗОВАНИЕ КОЛЬЦЕВОЙ ФОРМЫ ДНК БАКТЕРИОФАГА ЛЯМБДА ВКЛЮЧЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА В ХРОМОСОМУ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА ~ СИНТЕЗ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ, НЕОБХОДИМЫХ ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ НОВЫХ ВИРУСОВ ЕОО ф... (,з;** БЫСТРАЯ РЕПЛИКАЦИЯ инДУкцик О кк(ь) СВОБОДНОЙ ВИРУСНОЙ ДЕЛЕНИЕ ДНК И ЕЕ УПАКОВКА В ВИРУСНЫЕ ЧАСТИЦЫ г;и н ~~ фиь ЛИЗИС КЛЕТКИ сОЛРОВОжддется ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ВСТРОЕННАЯ ВИРУСНАЯ ДНК РЕПЛИЦИРУЕТСЯ гй (Е» лВ НОВЫХ ВИРУСНЫХ ВМЕСТЕ С ХРОМОСОМОЙ ХОЗЯИНА ЧВ % а' ЧАСТИЦ :ЛИЗОГЕННЫЙ ПУТЬ' ЛИТИЧЕСКИЙ Г(УТЪ Рис.
5.78. Жизненный цикл бактериофага А. Представленный здесь двухцепочечный ДНК-геном бактериофага К содержит 50 000 пар нуклеотидов и кодирует 50-60 различных белков Когда ДНК бактериофага К попадает в клетку, оба ее конца соединяются с образованием молекулы кольцевой ДНК. Этот бактериофаг может размножаться в Е сов литическим способом, который уничтожает клетку, или входить в латентное состояние профаге (л изоте нный путь) При повреждении клетки, несущей профа г Л, происходит активация литического пути: профаг выходит из хромосомы хозяина и переходит к литическому росту (красные стрелки).
Как вход ДНК бактериофага к в бактериальную хромосому, так и выход из нее опосредуется консервативной се йт специфической реном 6 и нацией, катализируемой ферментом К-интегразой (см, рис, 5.77). Ф.б,Т(уа((СВЦвй(ЗИЗ;МйРНСЕ(З(эсатм)тнам Сайт-.епбю(З(фЗЗЧ~СКйИРйв(вйт6ИЗаат((ан ".,4й9 а) '-В'9ЧЕЦИФИЦб(ёйа)(ТФ (((й(б(нй()(абб((ФР:~аз((к(4Ц-: с,в Ф с сайт (охр сайт 1охр АКТИВНЫЙ ГЕН йббй„ ((() ти Сге-рекомбинааа синтезируется только в клетках печени интересующий гвн удален из хромосомы и больше не реплицнруется в клетках печени б) В ЛИЯХ, Т((АУ(ЯХ Й((ТФРЕФг(6й9бй4'ЕН И(1рй(()ЛЬЬ((() фФМЕСФЫРУФВР(. С б Ю В / НЕАКТИВНЫЙ ГЕН сайт 1охР тквнеспецифичный промотор (например, промотор активен только в печени) б()) ч() (() Ф интересующий белок Рис.
579. Как синтезируемый бактерией фермент консервативной сайт специфической рекомбинации моямт быть использован для удаления заданнык генов из определенных тнаней мыши. Зтот подход требуетвстраиваниядвухспециальносконструированныхмолекулДНК взародышевуюлннию животною. Первая содержит ген рекомбиназы (в данном случае рекомбнназа Сге бактериофага Рт) под контролем тканеспецифическою промотора, что гарантирует экспрессию этой рекомбиназы только в этой ткани. Вторая молекула ДНК содержит интересующий нас ген, фпанкированный участками (в данном случае участками 1охр), узнаваемыми данной рекомбиназой Мышь проектируется таким образом, чтобы у нее была единственная копия этого гена. Поэтому если рекомбиназа зкспрессируется только в печени, то, значит, интересующий нас ген будет удален там и только там.
Как будет описано в главе 7, известно много тка песне цифичесхих промоторов; более того, многие из этих праматоров активны только в определенные моменты развития организма. Таким образом, возможно изучать последствия делетирования определенных генов на разных стадиях развития каждой ткани. Консервативные сайт специфические рекомбиназы бактерий также стали мощ ными инструментами в руках ученых в области клеточной биологии и биологии раз вития. Чтобы выяснить роль определенного гена и белка в сложных многоклегочных организмах, с помощью методов генной инженерии получают мышей, несущих ген, кодирующий фермент сайт специфической рекомбинации плюс тщательно разрабо танную конструкцию ДНК мишени с участками, специфически узнаваемыми этим ферментом.
В нужный момегп времени ген, кодируюгций эигт фермент, можно активи ровать и тем самым перестроить последовательность ДН К мишени. Такие перестройки широко используклся для делегирования (удаления) заданного гена в определенной ткани мыши (рнс. 5.79). Эта методология особенно полезна в тех случаях, когда интересующий ген играет определяющую роль на ранних стадиях развития многих тканей и его полное удаление из зародышевой линии вызвало бы смерть в самом 500 Часть 2.
Основные генетические механизмы начале эмбриогенеза. Та же стратегия может быть использована также и при неадекватной экспрессии любого заданного гена в интересующей ткани; в данном случае целенаправленная делеция позволит присоединить сильный промотор транскрипции к интересующему гену. Имея такой инструмент под рукой, можно, в принципе, определить действие любого белка в любой ткани организма животного. Заключение Геномьс почти всех организмов содержат мобильные генетические элементы, которые могут передвигаться из одной позиции генома в другую путем либо транспозиции, либо консервативной сайт-специфической рекомбинации.
В большинстве случаев такое перемещение носит случайный характер и происходит с очень н экой частотой. К мобильным генетическим элементам относят транспозоны, которые передвигаюпгся в пределах одной клетки (и ее потомков), плюс те вирусы, геномы которых могут встраиваться в геномы клеток-хозяев. Известно три класса транспозонов: ДНК-транспозоны, ретровирусподобные ретротранспозоны и неретровирусные ретротранспозоны. Все они, кроме последних, имеют близких родственников среди вгсрусов.
Хотя вирусы и транспонируемые элементы можно рассматргсвать как клеточных паразитов, многие из новых последовательностей ДНК, которые были созданы событиями сайт-специфической рекомбинации, порождали генетическую изменчивость, необходимую для эволюции клеток и организмов. Задачи Какие утверждения являются верными? Обоснуйте свой ответ 5.1. В вашем теле нет двух клеток с идентичной нуклеотидной последовательностью. 5.2. У Е.
со1г', репликационная вилка которой перемещается со скоростью 500 п.н. в секунду, ДНК перед вилкой должна вращаться со скоростью почти 3000 оборотов в минуту. 5.3. Когда двунаправленные реплнкацнонные вилки от смежных точек начала репликации встречаются, ведущая цепь всегда сталкивается с отстающей цепью. 5.4. Все механизмы репарации ДНК основаны на наличии в клетке двух копий генетической информации — по одной в каждой из двух гомолог ичных хромосом. Обсудите следующие проблемы 5.5. Чтобы определить воспроизводимость результатов измерений частоты мутаций, вы проводите следующий эксперимент. Вы засеваете 10 культур одной- единственной бактерией Е. со1г и позволяете культурам расти, пока каждая не будет содержать 10ь клеток, а затем измеряете в каждой культуре число клеток, которые несут мутацию в интересующем вас гене.
Вас настолько удивили предварительные результаты, что вы повторили эксперимент, дабы их подтвердить. Оба набора результатов дают картину чрезвычайно высокой изменчивости, как показано в таблице О5.1. При том что мы полагаем частоту мутаций постоянной, по какой причине, согласно вашим предположениям, имеет место столь разительное различие значений частоты встречаемости мутантных клеток в разных культурах? Таблица С)5.1. Частота появления мугантных хлеток в многочисленных хультурах (задача 5.5) 5.6. Ферменты репарации ДНК предпочтительно исправляют неправильно спаренные основания на недавно синтезированной цепи ДНК, используя старую цепь ДНК как матрицу. Если бы «несоответствия» устранялись без учета того, какая из цепей ДНК будет служить матрицей, то могла бы такая система устранс пия ошибок спаривания уменьшить число ошибок репликации? Привела бы такая неразборчивая система исправления ошибок к меньшему числу мутаций, большему числу мутаций или к тому же числу мутаций, что наблюдалось бы без репарации вообще? Поясните ваши ответы.
5.7. Если ДНК.полимераза требует «совершенной» затравки, спаренной по всем правилам. для присоединения следующего нуклеотида, то как же получается. что ошибочные нуклеотиды «избегают» действия полимеразы и становятся субстратами для ферментов исправления ошибок спаривания? 5.8. Лаборатория, к которой вы присоединились, изучает жизненный цикл вируса животных, который использует кольцевую двухцепочечную ДНК в каче стве носителя генома. Ваш план состоит в том, чтобы определить местоположение точки (точек) начала репликации и выяснить, протекает ли репликация в одном или обоих направлениях от точки начала репликации (однонаправленная или двунаправленная репликация).
Чтобы достичь своей цели, вы выделили репли цируюп(неся молекулы, расщепили их нуклеазой рестрикции, которая разрезает геном вируса на одном участке, получили линейную молекулу из кольцевой и ста ли изучать получившиеся молекулы с помощью электронного микроскопа. Часть молекул, которые вы наблюдали, представлена схематично на рис. ()5.1. (Учтите, что с помощью электронного микроскопа невозможно отличить ориентапикг одной молекулы ДНК от другой. ) Завтра вы должны представить ваши выводы остальным сотрудникам лабо ратории. Как вы ответите на два вопроса, поставленные перед вами вашим руко водителем? 1) В данном геноме имеется одна уникальная точка начала репликации или их несколько? 2) Репликация однонаправленная или двунаправленная? релликационные глазки 5.9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
