Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 77
Текст из файла (страница 77)
35.9.290Полипептидные цепи и дисульфидные мостики в инсулине.Часть V.Молекулярная физиологияРис. 35.10.Изучение белка с высокой радиоактивностью, выявляемойпосле импульсного введенияметки в аденому островковойткани поджелудочной железы,привело к открытию проинсулина (непрерывной линией показана радиоактивность, прерывистой - оптическая плотность при 280 нм).и В-цепи из 30 остатков; цепи инсулина ковалентно связаны между собой двумя дисульфидными мостиками (рис. 35.9). Аналогичное строение имеют инсулины другихвидов животных, в том числе человека. Каксинтезируется этот двухцепочечный белок?A priori можно предположить, что А- и В-цепи синтезируются по отдельности, затемони специфически связываются в результатенековалентных взаимодействий и далеемежду ними формируются правильно расположенные дисульфидные мостики.
Такоепредположение было проверено экспериментально; для этого определяли, можно лииз восстановленных А- и В-цепей получитьin vitro активный гормон с правильным расположением дисульфидных мостиков. Стимулом для этого исследования послужилиданные Анфинсена (Anfinsen), посвященныерибонуклеазе - одноцепочечному белку, способному к полной ренатурации после химического восстановления и развертыванияструктуры (разд.
2.12). Однако в случае инсулина был получен совершенно иной результат: менее 4% образованных in vitro молекул содержали правильные дисульфидныепары. Такой же низкий выход ренатурированного белка имел место и в случае с химотрипсином - трехцепочечнымферментом,имеющем две межцепочечные дисульфидные связи (разд. 8.2).
С другой стороны,химотринсиноген - одноцепочечный пред-Рис. 35.11.Последовательностьаминокислот в проинсулине свиньи;А-цепь инсулина показанакрасным цветом, В-цепь - синим, связующий пептид (С-пептид) - желтым.[Chance R.E.,Ellis R.M.,Bromer W.W..Science, 161, 165 (1968).]шественник химотрипсина - восстанавливалсвою структуру в значительно большей мере.
Различие в поведении химотрипсинаи химотрипсиногена наводило на мысльо том, что и инсулин не восстанавливалструктуры должным образом из-за частичного отсутствия необходимой для этого информации. Возник вопрос, не является лиинсулин, подобно химотрипсину, производным одной полипептидной цепи?Решающую роль в изучении этой проблемы сыграла работа Доналда Стайнера(Donald Steiner), проведенная на аденомеостровковой ткани поджелудочной железы.Эта редко встречающаяся опухоль человекапродуцирует большие количества инсулина.Стайнер инкубировал срезы опухоли с меченным тритием лейцином и далее проводил анализ.
Таким путем был обнаруженновый включавший большое количествометки белок (рис. 35.10). Последующие исследования показали, что этот белок, названный проинсулином, служит предшественником инсулина.Проинсулин представляет собой единуюполипептидную цепь, в которой есть последовательность примерно из 30 аминокислот, отсутствующая в инсулине (рис. 35.11).Это связующий пептид (С-пептид от англ.connecting - связующий); он расположен между карбоксильным концом В-цепи и аминоконцом А-цепи будущего инсулина.
Каки предполагалось, проинсулин обладает способностью к формированию правильно расположенных дисульфидных связей после обработкивосстанавливающимиагентамии последующего повторного окисления.Недавно проведенные исследования биосинтеза инсулина выявили, что проинсулин - это еще не исходная форма синтезированного гормона.
Новообразованная полипептидная цепь, попадающая в просветшероховатого эндоплазматичсского ретикулума, представляет собой так называемыйпрепроинсулин, который содержит N-концевую последовательность из 16 остатков, отсутствующую в проинсулине. По-видимому,этот N-концевой гидрофобный участок служит сигнальной последовательностью, направляющей новообразованную цепь в эндоплазматический ретикулум (разд. 29.30).Превращение препроинсулина в проинсулинпроисходит в просвете трубочек эндоплазматического ретикулума вскоре после прохождения препроинсулина через мембрану.35.
Действие гормонов291Далее образовавшийся проинсулин транспортируется в аппарат Гольджи, где начинается протеолиз соединительного пептида. Формирование инсулина из проинсулина(неактивного гормона) продолжается в секреторных гранулах. В проинсулинах животных разных видов С-пептиды имеют общие структурные особенности.
Так, вовсех изученных к настоящему времени проинсулинах связующий пептид содержитArg-Arg на N-конце и Lys-Arg на С-конце.Гидролиз полипептидной цепи по этим положительно заряженным остаткам осуществляется протеолитическим ферментом, сходным с трипсином. Секреция инсулина, накопленного в созревших секреторных гранулах, осуществляется при слиянии мембрангранул с плазматической мембраной клетки.35.10. Трехмерная структура инсулинаВ лаборатории Дороти Ходжкин (DorothyHodgkin) было проведено рентгеноструктурное исследование инсулина свиньи и раскрыта его трехмерная пространственнаяструктура при разрешении 1,9 А.
Эта работабыла завершена почти через 36 лет после того, как Ходжкин получила первые рентгенограммы кристалла белка (пепсина), будучистуденткой-дипломницей в лабораторииДжона Бернала (John Bernal). За прошедшиегоды Ходжкин расшифровала структуры та-Рис. 35.13.Рис. 35.12.292Ферментативное превращениепрепроинсулина в проинсулини далее в инсулин.Часть V.Молекулярная физиологияЭлектрононграммасодержащих инсулин секреторных гранул в β-клетках поджелудочнойжелезы. Инсулин образуетв гранулах мелкие кристаллы,что обусловлено его высокойконцентрацией в этих структурах.
(Печатается с любезногоразрешения д-ра Arthur Like.)ких биологически важных веществ, как холестерол, пенициллин и витамин В 1 2 . Инсулиноказался компактным трехмерным образованием (рис. 35.14), из которого «торчат»только N- и С-концы В-цепи. Между этимидвумя вытянутыми ветвями В-цепи располагается А-цепь. Структура имеет неполярную сердцевину, образованную обращенными внутрь алифатическими боковыми цепями остатков аминокислот, принадлежащихА- и В-цепям. Помимо дисульфидных мостиков, инсулин стабилизирован несколькими солевыми связями, а также водородными связями между определенными группами А- и В-цепей.
Конформация проинсулинаеще не исследована, но, судя по даннымспектроскопии, она очень сходна с конформацией инсулина. Об этом же свидетельствует способность проинсулина кристаллизоваться вместе с инсулином.35.11. Рецепторы инсулина локализованыв плазматической мембранеклеток-мишенейИнсулин прочно связывается со специфическими рецепторами на плазматическоймембране клеток-мишеней. Это выявляетсяв опытах с использованием радиоактивного инсулина, содержащего ковалентно связанный 125I.
Константа диссоциации инсулин-рецепторного комплекса составляетоколо 10 - 1 0 М. Необходимость в стольпрочном связывании объясняется низкойконцентрацией инсулина в крови (порядка10 - 1 0 М). Константа скорости образованиякомплексаоченьвелика(около107 М-1•с-1) и приближается к величине,характеризующей реакции, скорость которых регулируется только скоростьюдиффузии. Клетка жировой ткани содержит всего лишь 1•10 4 рецепторов инсулина, что соответствует плотности один рецептор на квадратный микрометр плазматической мембраны. Иными словами, одинбрецептор инсулина приходится на 1•10фосфолипидов мембраны.Параметры связывания инсулина с солюбилизированным рецептором и с рецептором в интактной плазматической мембране одинаковы.
Солюбилизированныерецепторы были очищены методом аффинной хроматографии, т. е. методом, основанным на использовании специфическихсвязывающих свойств рецептора. Дляочистки препарат солюбилизированныхмембран пропускали через колонку агарозы с ковалентно присоединенным инсу-Рис. 35.14.Схематическоеизображениеструктуры инсулина; показанытолько α-углеродные атомы.Красным обозначена А-цепь.синим - В-цепь.лином; рецепторы инсулина прочно связывались с колонкой, тогда как остальныекомпоненты смеси проходили сквозь колонку. Далее рецепторы инсулина элюировали подкисленным раствором мочевины,который вызывал денатурацию рецепторови их отделение от связанного с агарозойинсулина. По счастью, очищенные рецепторы удавалось затем ренатурировать путем удаления мочевины и повышения рНраствора.
Используя этот метод, ПедроКватрсказас (Pedro Cuatrecasas) очистилрецепторы инсулина в 250000 раз. Субъединица рецептора, связывающего инсулин,представляет собой гликопротеин массой135 кДа (рис. 35.15).На долю рецепторов инсулина приходится всего лишь 4•10-3% общего количества мембранных белков в гомогенатепечени. Следовательно, чтобы получитьв чистом виде 1 мг белка-рецептора, необходимо подвергнуть обработке количествогомогената, эквивалентное 500 г белка,а для этого нужно взять печень от 200крыс. Этот расчет показывает, что выделение рецепторов в количестве, достаточномдля определения последовательности аминокислот, рентгеноструктурного анализа35.
Действие гормонов293Диабет название указывает на повышенноеврач второго столетия н.э., писал:похожему на прохождение водыностью охарактеризовал диабет каквращение их в мочу».мочеиспускание. Аретей, каппадокийский«Эпитет «диабет» относится к состоянию,по сифону». Он с тонкой наблюдатель«растворение плоти и конечностей и пре-Сахарный (по латыни mellitus, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
