Biokhimia_T1_Strayer_L_1984 (1123302), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Почему? Мы выясним это в ходе дальнейшего изложения. 5.2. Дезокснгеннровяниьой серповилиоклеточный гемоглебня имеет пониженную растворимость Херрик высказал правильное предположение о локализации первичного дефекта, обусловливающего серповндноклеточную анемию, При снижении концентрации кислорода эритроциты больного приобретают серповидную форму на предметном стекле (п тйго. Оказалось, что в этих клетках дефектен сам гемоглобин. Растворимость дезоксигемоглобина серповидных клеток примерно в 25 раз ниже растворимости нормального гемоглобина.
При дезоксигенировании концентрированно~о раствора гемоглобина серповидных клеток образуется волокнистый осадок (рис. 5.3). Именно ~акой осадок деформирует зритроцит,придавая ему серповидную форму. Гемоглобин серповидных клеток принято обозначать как гемоглобин 5 (НЬ Я) в отличие от гемоглобина А (НЬ А) — нормального гемоглобина взрослого человека. 5.3. Гемоглобин Я отличается от гемоглобина А но электрофоретической подвижности В 1949 г. Полнит (Ранйпй) и его сотрудники изучали физико-химические свойства гемоглобина в норме, при носительстве признака серповидноклеточности и при заболевании серповидноклеточной анемией. Использованный ими экспериментальный подход состоял в следующем: они сопоставляли подвижность исследуемых гемоглобинов в электрическом поле. Метод определения подвижности в электрическом поле называется электрофорезам.
Скорость миграции (Г) белка (или какого-либо другого соединения) в электрическом поле зависит от напряженности электрического поля (Е), общего о0 О ра и с— ЕХ 7 рН Рис. 5,4. заряда белка (с) и сопротивления ~рения (7'). Сопротивление трения определяется разме- ром и формой белка. Указанные величины связаны между собой соотношением Изозлентрическая точка белка — это значение рН, при котором данный белок не несет электрического заряда. При таком значении рН электрофоретическая подвижность равна нулю, поскольку с = 0 [уравнение (1)2. При рН ниже изозлектрической точки молекула белка заряжена положительно; при значениях рН, лежащих выше изоэлектричсской точки, белок заряжен отрицательно.
Гемоглобин. серповидных клеток отличается от нормального по изозлектрнческой точке: Зависимость от рН злектрофоретической подвижности нормального гемоглобина и гемоглобина серповидных клеток. Ге о бин нор- мальны» Гем - Ра н- бин оерно- на нндиьп клеток зригрогГи- гое Океигемогнобин 6,87 Дезоаеигемогнобин 6,68 7,09 0,22 6,91 0,23 Как видно из приведенной таблицы, различие между серповидноклеточным и нормальным гемоглобином для окисленной н восстановленной форм одинаково. Различие в электрофоретической подвижности гемоглобина А и 5 может объясняться изменением либо общего заряда г., либо коэффициента трения/.
Сам по себе эффект трения (обусловленный изменением формы) выразился бы в том, что одно вещество двигалось бы медленнее другого во всем диапазоне рН. В рассматриваемом случае этого не происходило, судя по тому, что кривые зависимости электрофоретической подвижности от рН имели одинаковый угол наклона (рис. 5 4). Кроме того, другие физико-химические исследования, а именно определение скорости седнментацин н свободной диффузии показали, что коэффициенты трения оксигенированных форм гемоглобина А и гемоглобина 5 были одинаковы.
На основании этих наблюдений был сделан вывод о различии в числе или типе ионизированиых групп в сравниваемых гемоглобияах. Сколько таких групп в каждом из гемоглобинов? Ответ дает кривая кислот- но-основного тнтровання гсмоглобннов. В области рН 7 эта кривая почти линейна. Изменение рН раствора гемоглобина на единицу создает разницу почти на ! 3 зарядов. Стало быть, различие в изоэлектрических точках на 0,23 соответствует примерно трем зарядам в молекуле гемоглобина.
Отсюда следует, что гемоглобин серповидных клеток отличается от нормального наличием дополнительньгх 2 — 4 положительных зарядов. С чем связано это отличие: с изменением состава полипептидной цепи или с изменением гема? Из серповидноклеточного гемоглобина был выделен порфирии; по данным определения точки плавления и ренттеноструктурного анализа он оказался идентичен порфирину нормального гемоглобина. Это показывает, что различие между двумя гемоглобинами заключается в особенностях состава полипептидных целей. У больных серповидноклеточной анемией (всегда гомозиготных по дефектному гену) имеется гемоглобин Я н нет гемоглобина А. В то же время у носителей признака серповидноклеточности (которые гетерозиготны по гену серповндноклеточностн) оба гемоглобина содержатся примерно в равных количествах (рис.
5.5). Таким образом, в работе Полннга был выявлен бесспорный случай изменения молекулы белка при изменении аллелей коднрующего его гена. Это был первый пример молекулярной болезни. 5, Молекулярные болезни: серповидноклегочная анемия нь л НЫ Положительно за- Нейтральная аминокислОта раненная амино- кислота Положительно заряженная амино- кислота Отрицательно заря- женная амино- кислота Рнс.
5.5. Нейтральная амино- кислота Отрицательно заря- женная амино- кислота Эпвктрофо рвз в горизонтальном Хроматография в вертикальном Рнс. 5.6. 5.4. Получение пептидных карт: выявление аминокнслотиой замены в гемоглобнне серповидных клеток Итак,электрофоретический анализ показал, что гемоглобин Б имеет 2-4 дополнительных положительных заряда по сравнению с гемоглобином А. Возможны разные пути возникновения такого различия в заряде молекулы: Выяснение вопроса, какая конкретно замена произошла в гемоглобине Я, относится к 1954 г,, когда Вернон Ингрем (зт. 1пйгетп) разработал новый метод определения аминокнслотных замен в белках. Для проведения анализа молекулу гемоглобина расщепляли на фрагменты, поскольку в небольших пептидах, содержащих примерно по 20 аминокислот„выявить замену аминокислоты, безусловно, легче, чем в целой молекуле белка, значительно большей (в 10 раз) по размеру. Гемоглобин подвергали специфическому расщеплению трипсином по пептидным связям, образованным карбоксильными группами лизина и аргинина.
Смесь пептидов разделяют путем электрофореза в горизонтальном направлении с последующей хроматографией в вертикальном направлении. Часть 1 Конформации и динамика Признак СарповидноНорма серповидно- клеточная кпвточности анемия Электрофорез на крахмальном геле при рН 8,6 гемоглобина здорового человека, гемоглобина носителя признака серповидноклеточностн и гемоглобина больного серповидноклеточной анемией.
Поскольку в и()-половине гемоглобина содержится в общей сложности 27 остатков лизина и аргина, при триптическом гидрализе образовалось 28 разных пептидов. Следующий этап состоял в разделении полученных пептидов. Для этого был применен метод двумерного разделения (рис. 5.б). Смесь пептидов наносили в виде небольшого пятна в угол большого листа фильтровальной бумаги. Далее проводили электрофорез в одном направлении, разделяя таким образом пептцды в соответствии с их общим зарядом. Однако полного разделения смеси при этом не происходило. Многие пептиды накладывались друг на друга.
Поэтому продолжалн процесс разделения, но уже методом хроматографии на бумаге, причем это разделение проводили в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Хроматография— термин введен Михаилом Цветом в! 906 г. применительно к разделению смеси пигментов из листьев растения на колонке карбоната кальция. М.
Цвет сравнил этот процесс с «разложением света на спектр». Образовано от греческих слов сЬгоша-цвет и йгар)»еш — рисовать, писать. Процедура состояла в следующем: конец бумаги, ближайший к разделяемым пептидам, помещали в смесь органических растворителей и воды, налитую на дно герметично закрывающейся стеклянной банки. При этом растворитель поднимался вверх по бумаге.
В такой ситуации каждый пептид мог либо мигрировать с растворителем (не- полярная среда), либо оставаться на обводненной целлюлозе бумаги (высокополярная среда). Такой метод разделения называется распределительной хроматографией. Пептид с наиболее выраженными неполярными свойствами будет растворяться в растворителе и, следовательно, подниматься вместе с фронтом растворителя вверх по бумаге; в то же время самый полярный нз пептидов останется на бумаге внизу. Рассматриваемые методы — хроматография на бумаге и электрофорез — дополняют друг друга, поскольку они разделяют пепт|щы на основе независимых свойств; первый — на основе различий в полярности, второй -на основе различий в общем заряде. Вся последовательность проведения анализа — избирательное расщепление белка на небольшие пептиды сих последующим разделением в двух направлениях †называет методом пептидных карт (отпечатков пальцев).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
