Влияние некоторых веществ на определение формиата ферментативным методом (1113655), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Несмотря на преимущества дрожжевых ферментов, работы с нимизатруднены из-за быстрой их инактивации.Наиболее изученной и одной из наиболее устойчивых является формиатдегидрогеназа, выделенная из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 (ген этого фермента был-9-клонирован, секвенирован и экспрессирован в клетки E.coli в нашей лаборатории несколько лет назад). Молекула фермента представляет собой димер в виде вытянутого эллипсоидаи имеет линейные размеры 105×55×45 Е [15].
При переходе от апо- к холо- форме белковаяглобула становится более компактной, что все же не приводит к реорганизации структурных элементов.Касаясь вопроса об инактивации фермента, необходимо заметить, что она связана восновном с термическим и химическими воздействиями на белковую глобулу, приводящими к ее заметным конформационным изменениям. Во избежание этих процессов необходимо бывает удалять из раствора определенные вещества (в том числе, ионы металлов добавлением ЭДТА), а также не допускать значительного повышения температуры, т.к.
при60°С наблюдается заметная термоинактивация. Для качества исследуемого метода важно,что в соответствующих условиях (4°С) формиатдегидрогеназа Pseudomonas sp.101 можетхраниться в растворе без видимой потери активности в течение 3-4 лет, как было показанов нашей лаборатории.Ингибирование ферментаБлижайшие структурные аналоги муравьиной кислоты (ацетат, пропионат, оксалат,пируват, метанол и гидразин) проявляют довольно слабое сродство к ФДГ (Ki > 0.5 M). Однако многие простые неорганические анионы соперничают с формиатом за активный центрфермента. Их константы ингибирования различаются на несколько порядков. Тетраэдрические анионы, такие как перхлорат, фосфат, сульфат (за исключением тиосульфата), связываются достаточно слабо. Лучшими ингибиторами ФДГ являются линейные и плоскиеанионы с делокализованным отрицательным зарядом.
Линейные трехатомные анионы, например, азид или SCN-, могут считаться структурными аналогами продукта реакции, CO2, аплоские анионы – как NO2- – аналогами формиат-иона. Азид – соединение, изоэлектронноеCO2, – сильнейший ингибитор формиатдегидрогеназы. Прочное связывание этого аниона,+ведущее к образованию неактивного тройного комплекса, ФДГ-НАД -азид, было исследовано флюорометрическим титрованием активных центров ФДГ.На прочность связывания ингибиторов влияют следующие факторы:1. Общая геометрия: линейные молекулы связываются лучше плоских, например, N3>> NO2-, CO2 > HCOO-.22.
Природа центрального атома: SO3 - >> NO3- >> ClO3-.23. Природа периферийных атомов: S2O3 - > ClO4-.- 10 -Известно, что из-за большой электрофильности С-4 атома никотинамидного кольцаНАД образует аддукты с различными нуклеофилами, например, CN-, HSO3- и гидроксила++мином. Сравнение констант связывания ингибитора с НАД и с двойным комплексом ФДГ+НАД позволяет оценить энергию стабилизации при образовании тройного комплекса+ФДГ-НАД -ингибитор, которая в случае HSO3- равна приблизительно 29 кДж/моль. Силь-ный стабилизирующий эффект достигается, когда формиат (Kd ∼ 15 мМ) замещается втройном комплексе азидом (Kd ∼ 0.5 мкМ).
Крайне прочное связывание линейных анионовв активном центре позволяет рассматривать эти комплексы как стабильные аналоги переходного состояния [12].Все рассмотренные случаи ингибирования относятся к типу полного конкурентногоингибирования. В присутствии ингибитора скорость реакции равнаVi = (Vm*[S])/(Km+[S]+(Km/Ki)*[I]),где Ki - константа ингибирования, [I] - концентрация ингибитора. Величина (Km/Ki)*[I] называется степенью уменьшения скорости реакции в присутствии ингибитора. Константуингибирования определяют графически по методу Диксона, то есть построением зависимости 1/Vi от [I] (как легко убедиться, она линейна).
Абсцисса точки пересечения таких прямых будет численно равна Ki, взятой с противоположным знаком [1].Одна группа соединений занимает особое место среди ингибиторов ФДГ. Пиридоксаль (Ki ∼ 0.9 мМ) соперничает с формиатом как в свободном ферменте, так и в двойном+неактивном комплексе ФДГ-НАД . Размеры молекулы пиридоксаля и родственных соединений наводят на мысль, что они связываются не в активном центре, а в каком-то другомместе, являясь, таким образом, аллостерическими ингибиторами [12].В результате проведенного литературного обзора было выяснено, что некоторые вещества – ингибиторы формиатдегидрогеназы – могут существенно замедлить время анализа и повлиять на точность его результатов.
Поэтому измерение констант ингибированияэтих веществ необходимо для выяснения того, в каких концентрациях их присутствие в определяемой смеси недопустимо. Было решено измерить константы ингибирования четырехвеществ – азид-иона, роданид-иона, нитрит-иона и нитрат-иона.- 11 -Экспериментальная частьМатериалыВ экспериментах по определению констант ингибирования использовались: никоти+намидадениндинуклеотид (НАД ) фирмы “Sigma” (Германия), ЭДТА фирмы “Merck”, отечественные реактивы марки “ч.д.а”: KH2PO4, KOH, HCOONa, NaN3, KSCN, NaNO2, NaNO3.В качестве катализатора использовалась рекомбинантная формиатдегидрогеназа изметилотрофныхбактерийPseudomonassp.101судельнойактивностью15 ед/мл.Приготовление и подготовка растворовДля приготовления растворов, необходимых в ходе эксперимента, была использованадистиллированная вода.
Все измерения проводились в 0.1 М калий-фосфатном буферномрастворе с рН 7.0.Стандартный раствор формиата с концентрацией 0.5 М был приготовлен растворением навески соли в воде. Стандартные растворы азида с концентрацией 10-5 и 10-6 М готовились разведением 10-4 М раствора соли, который, в свою очередь приготовили растворением навески в воде. Растворы других ингибиторов готовились также. Использовались следующие растворы: 10-4 и 10-3 М роданид, 10-3 и 0.01 М нитрит, 0.01 и 0.1 М нитрат.Использованная аппаратураСпектрофотометрические определения проводились в кюветах с длиной оптическогопути 1 см на спектрофотометре “Beckman DU-8B” (США) с кюветным отделением, термостатируемым при 37°С и точностью определения 0.001.
В работе были использованы весы“Sartorius” (Германия) с точностью взвешивания 0.01 мг.Метод определенияИзмерения начальных скоростей реакций проводились в калий-фосфатном буфере.Готовили 5 серий по 7 кювет, так что в каждой серии концентрация формиата была одинаковой, а концентрация ингибитора менялась от 0.1 Ki до 10 Ki. В различных сериях концен+трация формиата была разной и менялась от 5 до 50 мМ. Концентрация НАД в кювете была 2 мг/мл, что составляет более 30 Km.
Реакция инициировалась добавлением в кюветуаликвоты фермента. Измерение проводилось спектрофотометрически по накоплению продукта реакции НАД*Н на длине волны 340 нм при 37°С. При этом протекала ферментативная реакция:–+HCOO + НАД –––––> CO2 + НАД*Н- 12 -ФДГДалее с помощью программы “Sigma Plot 4.0” строилась зависимость в координатах1/Vi от [I]. Для построения одной прямой использовалось 7 точек, соответствующих семиразличным концентрациям ингибитора. Абсцисса точки пересечения полученного семейства из пяти прямых давала значение константы ингибирования с обратным знаком, как описано выше.Обсуждение результатовЦелью эксперимента явилось определение констант ингибирования четырех веществ– азида, роданида, нитрата и нитрита.
В результате были получены следующие данные (см.также рис. 1-4).Таблица 1. Результаты экспериментаИнгибиторАзидРоданидНитритНитратKi4.38*10-82.52*10-58.88*10-42.47*10-4I504.38*10-82.52*10-58.89*10-42.47*10-4Sr0.06710.03800.08750.0381δ=(tp,f*Sr)/n3.08*10-91.00*10-68.16*10-59.90*10-6- 13 -1,00,81/V i0,60,40,20,0-1,0-0,50,00,51,01,52,0[N3-], 10-7 MРис. 1. Ингибирование формиатдегидрогеназы NaN3- 14 -2,53,03,50,50,41/V i0,30,20,10,0-4-3-2-101[SCN-], 10-5 MРис. 2. Ингибирование формиатдегирогеназы KSCN- 15 -230,50,41/V i0,30,20,10,0-10-8-6-4-20[NO2-], 10-4 MРис.
3. Ингибирование формиатдегидрогеназы NaNO2- 16 -20,80,61/V i0,40,20,0-0,2-4Hb-3-2-101[NO3-], 10-4 MРис. 4. Ингибирование формиатдегидрогеназы NaNO3- 17 -23Константы вычислялись следующим образом: по параметрам прямых, найденнымметодом наименьших квадратов, искались всевозможные попарные точки их пересечения.Среднее значение абсцисс таких точек и давало константу ингибирования с обратным знаком.В процессе обработки данных были вычислены относительное стандартное отклонение (Sr) и доверительный интервал (δ) измерения константы ингибирования для каждоговещества. Видно, что Sr не превышало 0.1, а в лучшем случае было порядка 0.04.
Константы для нитрата и роданида были определены с большей точностью, чем для нитрита и азида.В отличие от литературных данных, в результате проведенного эксперимента былонайдено, что Ki нитрита больше Ki нитрата.В химическом анализе иногда используют величину I50 (или ее отрицательный десятичный логарифм pI50), равную концентрации ингибитора, при которой скорость реакцииснижается вдвое по сравнению со скоростью реакции в отсутствие ингибитора [16]. В случае полного конкурентного ингибирования I50 связана с константой ингибирования следующим образом:I50 = Ki*(1+[S]/Km).Из этого выражения видно, что в случае полного конкурентного ингибирования I50 неможет служить мерой ингибирующей способности эффектора при произвольной концентрации субстрата. Однако для оценки значения I50 можно принять концетрацию субстратаравной нижней границе определяемых содержаний (см. табл.
1). При таких концентрацияхингибитор существенно замедляет ферментативную реакцию и может увеличить времяанализа в несколько раз.ВыводыПроведенный эксперимент показал, что ферментативному определению формиатиона мешают: азид в концентрации 4.38*10-8 М, роданид в концентрации 2.52*10-5 М, нитритв концентрации 8.89*10-4 М. нитрат в концентрации 2.47*10-4 М.
В количествах, превышающихданные, эти вещества недопустимо замедляют ферментативную реакцию и делают определение формиата практически невозможным.- 18 -Список литературы1.Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативнойкинетики. М.: Изд. МГУ. 1976.2.Бауэр Э. Анализ органических соединений. М.: Изд. иностр. лит., 1953.3.Кульберг Л.М., Иванова З.В. Открытие некоторых органических кислот приих совместном присутствии // Журн. анал.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
