Влияние некоторых веществ на определение формиата ферментативным методом (1113655), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Поэтому для определения карбоновых кислот указанным методом их вначале переводят в метиловые эфиры, имеющие более низкую температуру кипения. Для муравьиной кислоты иногда удобнее использовать не метиловый, а этиловый и более высокие эфиры, получение которых составляет стадию пробоподготовкиГЖХ [7].-5-Газожидкостная хроматография предъявляет множество требований к каждому изэтапов анализа.
Практически их совместное выполнение не всегда возможно, поэтомуобычно относительная погрешность метода в лучшем случае не превышает 4%. К недостаткам метода также относится длительность и сложность пробоподготовки образцов. Метод ГЖХ не позволяет проводить совместное определение органических кислот в присутствии неорганических.Ионообменная хроматографияМетод хорош тем, что позволяет отделить муравьиную кислоту от ее гомологов засчет ее малых размеров и относительно сильного отличия константы диссоциации.
Пределобнаружения формиата при элюировании раствором соли бензойной или фталевой кислотысоставляет около 0.5-1 мг/л, и около 0.05-0.5 мг/л, если в качестве эталона используютсярастворы самих кислот [7].Небольшая модификация ИОХ – ионоэксклюзивная хроматография, применимая длянеполярного разделения слабоионизированных соединений, в том числе карбоновых кислот. В качестве элюента здесь используются растворы некоторых кислот.Хроматомасс-спектрометрияСоединение масс-спектрометра с газожидкостным хроматографом может быть успешно применено при определении муравьиной кислоты в смесях. Хроматограф количественно разделяет многокомпонентные смеси, в то время как масс-спектрометр идентифицирует соединения.
Так как масс-спектры одноосновных карбоновых кислот малоинтенсивны, для данного метода исследования их обычно переводят в более летучие эфиры [8]. Несмотря на все преимущества метода, он более эффективен при качественном анализе, таккак при переходе исследуемой смеси в ионизационную камеру почти неизбежна частичнаяпотеря компонентов с нарушением концентрационных соотношений [9].Ферментативный метод определения формиатаДля определения формиата разработано несколько ферментных методов. Наиболееизвестен метод с тетрагидрофолатформилазой, а также методы определения формиатаформиатдегидрогеназами, выделенными из гороха и Pseudomonas oxalaticus. Однако упомянутые методы страдают существенными недостатками. Кинетический метод, разработанный на основе малатдегидрогеназы из E.coli, малоспецифичен.
Определение с тетрагидрофолатформилазой связано со значительной продолжительностью определения и с использованием труднодоступной тетрагидрофолиевой кислоты. Применение других ферментных методов ограничено из-за высокой лабильности используемых ферментов, это относится, в частности, к препаратам из E.coli и к формиатдегидрогеназе из Pseudomonas ox--6-alaticus. Наиболее приемлемым методом является, таким образом, определение формиатапри помощи формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.
101 [10].Предлагаемый метод специфичен по отношению к формиату. В отсутствие формиатаНАД не восстанавливается в присутствии 0.1 М раствора метанола, этанола, формальдегида, ацетальдегида, молочной, уксусной, пировиноградной, малоновой кислот.Определение формиата ферментативным методом проводится следующим образом. В+кварцевые кюветы добавляют раствор НАД в калий-фосфатном буфере с рН 8.0, содержащем также 0.01 М ЭДТА, затем необходимое количество формиата и буфер. Далее в кювету помещают раствор фермента, быстро перемешивают и снимают показания со спектрофотометра (абсолютное значение оптической плотности и ее приращение за минуту).Дожидаются полного окончания реакции и снимают конечное значение оптической плотности [11].В основе метода лежит линейная зависимость оптической плотности раствора от изменения концентрации вещества, в согласии с законом Бугера-Ламберта-Бэра:A = ε*l*c (или ∆A = ε*l*∆c)где A – оптическая плотность, l – оптическая длина пути в сантиметрах, ε – коэффициентмолекулярного поглощения (для НАД*Н при λ=340 нм эта величина составляет 622.0л/(моль*см)).
Проведение спектрофотометрических измерений именно на этой длине вол+ны связано с тем, что она характеризуется практически нулевым поглощением НАД . Поглощение света ферментом не мешает определению, так как не меняется в ходе реакции.Поскольку до начала реакции растворы в кюветах характеризуются ненулевым поглощением, аналитическим сигналом в описываемом методе служит не абсолютное значение оптической плотности, а ее изменение. Конечная оптическая плотность измеряется тогда, когдаее приращение за минуту не превышает тысячной доли оптической единицы.
Время анализа составляет, в зависимости от концентрации формиата, от единиц до нескольких десятковминут. Кроме того, время анализа обратно пропорционально концентрации фермента, однако, результат измерения от нее не зависит, что является одним из удобств метода.Получены следующие аналитические характеристики метода:-предел обнаружений составляет ~ 5*10-6 М;-нижняя граница определяемых содержаний (СН) ~ 10-5 М, верхняя граница ~10-4 М;-относительное стандартное отклонение (Sr) в процессе измерения не превышает 0.05, а в рабочем диапазоне концентраций остается на уровне 0.02.-7-Уместно заметить, что для хроматомасс-спектрометрии Sr ≈ 0.1, СН ≈ 2*10-6, для ионной хроматографии Sr ≈ 0.03, СН ≈ 5*10-6, то есть ферментативный метод составляет имвполне достойную конкуренцию.
Более точные результаты (СН ≈ 10-6 М) могут быть получены модификацией описываемого метода (при флуорометрическом детектировании количества НАД*Н). По сравнению с существующими ферментативными методами, данныйметод отличается широким диапазоном определяемых концентраций, доступностью, стабильностью и высокой активностью используемых препаратов, простотой.На стадии пробоподготовки необходимо удалить мешающие анализу вещества. Прианализе биологических объектов такими являются, например, протеолитические ферменты,гидролизирующие пептидные связи белка, а также ферменты, разрушающие или связы+вающие любую форму НАД или формиат-иона.
Белки в пробе можно разрушать нагреванием (до ~60°С) или воздействием сильной щелочи или кислоты. Значительным понижением рН можно также способствовать разрушению азид-иона, сильнейшего ингибитора формиатдегидрогеназы. Однако необходимо учесть, что перед началом анализа рН растворадолжен быть близким к 7 или немного больше, в нем не должно быть сильных окислителейи восстановителей, желательно, чтобы раствор был дегазированным.Источники погрешностей метода различаются в зависимости от концентрации субстрата. При низких количествах формиата наибольший вклад в погрешность вносят: точность мерных емкостей (пипеток и т.д.), окисление НАД*Н и погрешности, связанные снедостаточной чистотой реактивов.
При высоких содержаниях анализируемого компонентавозрастает влияние инструментальных погрешностей [6]. В реальных системах причинойошибок могут стать еще и недостаточно хорошо спланированные и проведенные пробоотбор и пробоподготовка.Другие методыКроме рассматриваемого в работе метода, существуют и другие ферментативные методы определения формиата, например, кинетические.
В этом случае вывод о содержании ванализируемой пробе формиат-иона делается на основании начальной скорости реакции.Можно вести определение и по флюоресценции НАД*H в конечной точке.+Некоторые свойства НАД -зависимой ФДГОбщие свойства ФДГФормиатдегидрогеназы относятся к числу ферментов, играющих исключительноважную роль в метаболизме метилотрофных организмов.
Они катализируют реакцию-8-HCOO- до СО2. Этот процесс представляет собой последнюю стадию в полиферментативной цепи окисления метанола до углекислого газа и является источником энергии для метилотрофных организмов при росте на метилсодержащих средах.Большинство известных к настоящему времени формиатдегидрогеназ состоят из двухидентичных субъединиц молекулярной массой 35-48 кДа каждая (1 килодальтон равен1000 а.е.м.). Каждая такая субъединица имеет один активный центр и не содержит простетических групп и ионов металлов [12].Скорость катализируемой реакции при фиксированном количестве фермента и избытке субстрата находится из классического уравнения Михаэлиса-Ментен:V = (Vm*[S])/([S]+Km),где [S] – концентрация субстрата, Vm – максимально возможная скорость реакции (при неизменных температуре, давлении и концентрации фермента), а Km – константа Михаэлиса,чей кинетический смысл – численное значение концентрации субстрата, при котором скорость вдвое меньше Vm.
Известные формиатдегидрогеназы имеют близкие значения кон+станты Михаэлиса по НАД (60 – 110 мкМ) и по формиату (2 –15 мкМ), однако удельнаяактивность ФДГ из бактерий в несколько раз выше, чем у фермента из других источников[12]. Подавляющее большинство формиатдегидрогеназ имеет достаточно широкий рНоптимум активности. Максимальная скорость катализируемой реакции остается практически постоянной в диапазоне стабильности белка (рН 5.0 – 10.5), а константы Михаэлиса по+НАД и по формиату постоянны в интервале рН 6.0 – 9.0.
При заметном изменении кислот+ности среды наблюдается ощутимое возрастание Km как по НАД , так и по формиату [13].Общим для всех формиатдегидрогеназ является также их относительно высокое содержание в клетках. Например, при культивировании на метаноле в качестве единственного источника углерода как бактерий, так и дрожжей, содержание ФДГ в этих клетках составляетдо 18-20% от общего количества растворимых белков.Формиатдегидрогеназы проявляют по отношению к формиату высокую специфичность, не окисляя метанол, ацетат, формальдегид и многие другие органические вещества.Бактериальные ферменты, в отличие от дрожжевых, обладающих исключительной специфичностью, могут использовать в качестве субстрата наряду с формиатом Sформилглутатион, а также ряд тиоэфиров муравьиной кислоты (которые, к счастью, быстрогидролизуются) [14].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
