Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации (1105654), страница 25
Текст из файла (страница 25)
в-в/л/чСреда-13,77±0,140,51±0,0113,53±0,3174±3Среда-25,05±0,190,85±0,0316,83±0,62101±4Среда-34,26±0,160,62±0,0214,55±0,5284±3Среда-43,36±0,120,47±0,0113,99±0,3466±2*Состав питательной Cреды-1 (г/л): глюкоза – 20, (NH4)2SO4 – 4, KH2PO4 – 13,3, MgSO4×7H2O – 1,2,лимонная кислота – 1,7, раствор микроэлементов – 10 мл. Раствор микроэлементов содержит (г/л в 0,1 МHCl): FeSO4×7H2O – 10, ZnSO4×7H2O – 2,25, CuSO4×5H2O – 1,0, MnSO4×4H2O – 0,5, CaCl2×2H2O – 2,0,H3BO4 – 0,3, (NH4)6Mo7O24 – 0,1. Составы Cред 2, 3 и 4 аналогичны составу среды 1 за исключением того,что в них вместо (NH4)2SO4 вводились CO(NH2)2, NH4Cl и NH4NO3, соответственно.130Как видно из полученных результатов, наибольшая концентрация биомассы клетокC. necator и средняя скорость ее накопления наблюдались при культивировании клеток впитательной Среде-2, где источником азота являлась мочевина, что коррелировало с ранееизвестными литературными данными [203, 204].
При этом внутриклеточное содержаниеПГА не превышало 16,83±0,62 % от сухого веса биомассы. Таким образом, Среда-2,содержащая в качестве источника азота мочевину (CO(NH2)2), оказалась наиболеепредпочтительной для наращивания биомассы клеток C. necator.Далее для получения ПГА биомасса клеток C. necator, накопленная в Среде-2,переносилась в свежую питательную Среду-2, лимитированную по источнику азота исодержащую, как и прежде, 20 г/л глюкозы. Эта концентрация глюкозы была выбрана какнаиболее благоприятная для накопления ПГА, исходя из анализа известных литературныхданных [202, 205]. С целью исследования влияния исходной концентрации биомассы наобщее количество накапливаемого внутриклеточного ПГА исходная концентрация клеток всреде варьировалась от 1,0 до 5,0 г сух.
в-в/л (Рисунок 40, Таблица 28).Установлено, что увеличение начальной концентрации биомассы в среде от 1,0 до 3,0г сух. в-в/л способствовало повышению итоговой концентрации ПГА в 3,1 раза, а скоростинакопления полимера в клетках в 1,3 раза, однако практически не влияло на конечноепроцентное содержание ПГА в клетках.
При увеличении концентрации клеток от 3,0 до 5,0 гсух. в-в/л наблюдалось повышение конечной концентрации ПГА в 1,2 раза; и хотя итоговоевнутриклеточное содержание ПГА несколько снижалось (на 7 %), что, очевидно, былосвязано с нехваткой субстрата (глюкозы) на дальнейший синтез полимера, скоростьнакопления полимера повышалась в 1,9 раза, что позволило сократить продолжительностьэксперимента на 10 ч. В связи с этим именно исходная концентрация клеток СБМ0=5г сух. в-в/л была признана оптимальной и использовалась в дальнейших экспериментах.Следует отметить, что во всех случаях отмечено именно накопление ПГА в составебиомассы.
Концентрация остаточной биомассы, определяемая как разница междуконцентрациями биомассы с ПГА и отделенного ПГА, практически не изменялась (Таблица28).Микроскопирование образцов клеток C. necator с различным содержанием ПГАвыявило наличие разницы между ними по размерам (Рисунок 41).131АБВРисунок 40 – Кинетика накопления биомассы клеток C. necator (А) и ПГА в них (Б), ипотребления глюкозы (В) в среде, лимитированной по источнику азота, при различнойисходной концентрации клеток в среде: 1,0 (▲), 3,0 (■), 5 (♦) г сух.
в-в/л132Таблица 28 – Характеристики процесса накопления ПГА клетками C. necator приварьировании исходной концентрации клеток и глюкозы в Среде-2, лимитированной поисточнику азотаИсходная концентрация глюкозыCГЛ0, г/лИсходная концентрация биомассыC. necator, г сух. в-в/лДлительность процесса, ч20301,03,05,01025155020Потребление глюкозы27,5±0,8 87,5±1,3 98,5±1,5 64,3±1,2 33,0±1,0Δ СГЛ, %Максимальная концентрация2,90±0,10 8,98±0,33 11,92±0,48 11,65±0,45 10,68±0,41биомассы C. necator, г сух.
в-в/лМаксимальная концентрация ПГА2,07±0,06 6,48±0,19 7,76±0,21 7,49±0,21 6,52±0,18С ПГА, г/лВнутриклеточное содержание71,38±2,13 72,16±2,14 65,10±1,81 64,29±1,84 61,05±2,32ПГА, %Средняя скорость накоплениябиомассы190±5239±7461±12332±9284±8QС, мг сух. в-в/л/чСредняя скорость накопления ПГА190±5239±7461±12332±9284±8QПГА, мг/л/чКлетки, содержащие незначительную (до ~16 %) концентрацию ПГА, имели размер от1,0 до 3,0 мкм. При увеличении концентрации ПГА в клетках до 65÷70 % было заметно ихувеличение в размере, который варьировался в пределах 4÷8 мкм, при этом в единичныхслучаях встречались «гигантские» клетки длиной до 15÷20 мкм. Поскольку известно, чторазмер клеток часто зависит от их возраста, то результаты микроскопирования лишний разподтверждали факт того, что в выросших клетках происходило накопление ПГА без ихактивного роста.Было исследовано также влияние исходной концентрации глюкозы в среде наэффективность накопления ПГА в заранее выращенных клетках C.
necator в среде,лимитированной по источнику азота (Рисунок 42, Таблица 28).Установлено, что наибольшая итоговая концентрация ПГА и максимальное значениесредней скорости накопления полимера наблюдались при исходной концентрации глюкозы всреде 20 г/л, которая, таким образом, оказалась оптимальной для исследуемого процесса(Таблица 28).
Более высокая начальная концентрация глюкозы в среде, вероятно,ингибировала процесс накопления ПГА, способствуя появлению 3-5 часовой лаг-фазы. Приэтом потребление глюкозы и итоговая концентрация ПГА уменьшались.133А2 мкмБ4 мкмРисунок 41 (А) – Внешний вид клеток C. necator В-8619, полученных при культивировании вСреде-2, не лимитированной по источнику азота (содержание ПГА до 16 %), и (Б) клетокC. necator В-8619, накопивших ПГА при культивировании заранее выращенных клеток ивнесенных в Среду-2, лимитированную по источнику азота (содержание ПГА до 72 %) (Б).Микроскоп Биомед (Россия) с насадкой БиомедЛюм206070112209 и цифровой камерой длямикроскопа Myscope 500M (увеличение в 100 раз)Таким образом, на примере синтетических глюкозосодержащих питательных сред прииспользовании подхода, основанного на предварительном выращивании клеток на азотсодержащей питательной среде с последующим их переносом в среду, лимитированную поисточнику азота, была показана возможность и оптимизированы условия накопления ПГА(СПГА = 7,76±0,21 г/л, QПГА = 461±12 мг/л/ч) в составе биомассы клеток C.
necator (СБМ0 = 5,0г сух. в-в/л, СГЛ0 = 20 г/л) в течение 15 ч.134Рисунок 42 – Кинетика потребления глюкозы (белые символы) и накопления ПГА клеткамиC. necator (черные символы) в Среде-2, лимитированной по источнику азота, при различнойисходной концентрации глюкозы: 20 (Δ, ▲), 30 (○,●), 50 (□, ■) г/л (исходная концентрацияклеток в среде 5,0 г сух. в-в/л)Наиболее интересным и значимым, с практической точки зрения, представлялосьисследование возможности получения ПГА с использованием такого возобновляемогосырья, как биомасса микроводорослей. Ранее этого никто не делал.
Следует отметить, чтоприготовить среду для культивирования клеток C. necator, продуцирующих ПГА, сприменением биомассы микроводорослей C. vulgaris в качестве источника глюкозы приконцентрации последней 20 г/л достаточно просто. Поэтому следующим этапом работы былоисследование возможности использования ферментолизата биомассы микроводорослейC. vulgaris в качестве основного компонента питательной среды для получения ПГА.При проведении всех этих экспериментов клетки бактерий C.
necator, выращенные впитательной Среде-2, переносились в жидкую фазу ферментативного гидролизата биомассымикроводорослей C. vulgaris, отделенную от осадка центрифугированием (6000 об/мин, 10мин). Для поддержания рН 7,0±0,2 в такой среде в процессе культивирования клетокC. necator использовался 2 М раствор КОН. С целью выбора наиболее благоприятныхусловий проведения эксперимента было рассмотрено влияние исходной концентрациибиомассы C. vulgaris, взятой для приготовления ферментолизатов, на эффективность135процесса накопления ПГА. Для исследований был выбран диапазон концентраций биомассыC.
vulgaris 30-70 г сух. в-в/л, обеспечивающих получение ферментолизатов, содержащихконцентрации ВС, близкие к значению 20 г/л. Начальная концентрация клеток C. necator вотцентрифугированных ферментолизатах была 5,0 г сух. в-в/л (Рисунок 43, Таблица 29).АБРисунок 43 – Кинетика накопления биомассы клеток C. necator (А) и ПГА в них (Б) прииспользовании отцентрифугированных ферментолизатов биомассы C.
vulgaris, полученныхпри различной ее исходной концентрации: 30 (●), 50 (▲), 70 (■) г сух. в-в/лИз полученных результатов видно, что при увеличении исходной концентрации ВС от14,7 до 24,1 г/л (Таблица 29) в составе ферментолизатов биомассы C. vulgaris наблюдалосьповышение суммарной концентрации ПГА в 1,5 раза, внутриклеточного содержания ПГА – в1,2 раза и средней скорости накопления полимера – в 1,1 раза. Дальнейшее увеличениеисходной концентрации ВС до 33,0 г/л в составе ферментолизатов биомассы C.
vulgaris неприводило к повышению получаемой суммарной концентрации ПГА и, соответственно,внутриклеточного содержания ПГА, кроме того при этом наблюдалось появление 3-4 ч лагфазы в начале культивирования клеток C. necator.136Таблица 29 – Характеристики процесса накопления ПГА клетками C. necator в среде сгидролизованной биомассой C.
vulgaris при варьировании ее исходной концентрации в средеИсходная концентрация биомассы C. vulgaris,взятой для получения ферментолизатов, г сух. в-в/лИсходная концентрация ВС в ферментолизатахСВС0 , г/лИсходная концентрация глюкозы вферментолизатахСГЛ0, г/лДлительность процесса, чМаксимальная концентрация биомассы C. necator,г сух. в-в/лМаксимальная концентрация ПГАС ПГА г/лВнутриклеточное содержание ПГА, %Средняя скорость накопления биомассыQС, мг сух.
в-в/л/чСредняя скорость накопления ПГАQПГА, мг/л/ч30507014,70±0,4124,10±0,8533,00±1,1811,88±0,319,40±0,5825,98±0,851015208,96±0,3411,60±0,4511,41±0,404,57±0,126,91±0,206,71±0,1951,00±1,3159,57±1,7558,81±1,72396±10440±13320±9373±10405±12294±8Таким образом, наиболее целесообразным оказалось в исследуемом процессеиспользовать ферментолизаты, полученные из биомассы микроводорослей C.
vulgaris сисходной её концентрацией 50 г сух. в-в/л.МикроскопированиеобразцовклетокC.necator,накопившихПГАприкультивировании в отцентрифугированных ферментолизатах биомассы C. vulgaris (Рисунок44), показало их морфологическую схожесть с клетками, накапливающими ПГА при ихкультивировании в питательной среде с чистой глюкозой (Рисунок 41 Б).Следует отметить, что данных об использовании гидролизатов микроводорослей дляполучения ПГА в литературе не обнаружено, то есть впервые в данной работе была показанапринципиальная возможность их применения в качестве среды для накопления ПГАклетками C. necator.Сравнение полученных результатов с имеющимися в литературе данными (Таблица 8)для процессов накопления ПГА клетками C.
necator при использовании в качестве исходногосырья различных гидролизатов и отходов производств, позволило заключить, чтогидролизатыбиомассымикроводорослейC.vulgarisмогутявлятьсяприемлемымкомпонентом сред, предназначенных для получения ПГА.Таким образом, подводя итоги исследований процессов получения ПГА изферментолизатов биомассы микроводорослей C. vulgaris, можно сделать следующиевыводы:1374 мкмРисунок 44 – Внешний вид бактерий C.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
