Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorellavulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации (1105654), страница 22
Текст из файла (страница 22)
succinogenes (см. п. 1.4). Использование в биотехнологии иммобилизованных клеток ввиде гетерогенных биокатализаторов является целесообразным подходом к организациитаких процессов с точки зрения упрощения технического оформления (в частности, стадийотделения клеток от среды культивирования) и с экономической точки зрения (отсутствуютзатратынанаращиваниесвежейбиомассыдлякаждогоциклапериодическогокультивирования).Ранее в лаборатории экобиокатализа Химического факультета МГУ имениМ.В.Ломоносова был разработан, оптимизирован и успешно реализован способ получениябиокатализаторов в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток мицелиальных грибовдля процессов получения органических кислот (молочной и фумаровой) [111, 169].
Клеткибактерий A. succinogenes, являющиеся наиболее активным продуцентом ЯК, ранее никто непытался использовать в иммобилизованном виде, применяя криогель ПВС в качественосителя. Ввиду этого актуальной представлялась разработка нового биокатализатора в видеиммобилизованных в криогель ПВС клеток A. succinogenes для получения ЯК, определениеосновных каталитических характеристик биокатализатора и сравнение эффективности егодействия со свободными клетками тех же бактерий.3.3.2.1 Характеристики процесса получения ЯК под действием свободных клетокбактерий A. succinogenes В-10111Для проведения исследований применялись клетки бактерий A.
succinogenes В-10111,полученные из ВКПМ. Первоначально на «среде роста», содержащей в качестве субстрата 20г/л глюкозы (см. п. 2.2.1) при рН 6,8±0,2 была исследована кинетика роста клетокA. succinogenes. Процесс велся анаэробно в течение 18ч при температуре 37 оС с постояннымперемешиванием (180 об/мин) (Рисунок 32).Как видно из полученных результатов, максимальная концентрация клеток в среде 3,0 г сух. в-в/л, накапливается к 12 ч их культивирования.
Удельная скорость роста клетоксоставила = 0,20±0,01 ч-1, средняя скорость накопления биомассы QC = 0,25±0,01г сух. в-в/л/ч.В конце экспоненциальной фазы (на 12 ч культивирования), когда накапливалосьмаксимальноеколичествопродуктивнойбиомассы,клеткиA.succinogenesконцентрировались центрифугированием (8000 об/мин, 15 мин). С целью максимизациипродуктивности процесса по ЯК и снижения скорости роста (т.е. снижения затрат субстрата115на прирост биомассы) для проведения исследований процесса получения ЯК свободнымиклетками в «рабочей среде», содержащей 50 г/л глюкозы (см. п.
2.2.1), биомассаиспользовалась в виде концентрированной суспензии.Рисунок 32 – Кинетика роста свободных клеток A. succinigenesИсходная концентрация клеток бактерий в среде составляла 3,0 г сух. в-в/л, pH средыдоводился до 6,8±0,2 добавлением 2 М раствора Na2CO3. В ходе проведения экспериментадля поддержания pH 6,8±0,2 использовался MgCO3 (25 г/л). Процесс велся анаэробно притемпературе 37 оС с постоянным перемешиванием (180 об/мин). С целью выбора наиболееблагоприятных условий проведения эксперимента было рассмотрено влияние исходнойконцентрации глюкозы в среде, которая варьировалась в диапазоне от 50 до 100 г/л, наэффективность процесса накопления ЯК (Рисунок 33, Таблица 20).Установлено, что увеличение исходной концентрации глюкозы от 50 до 100 г/лприводит лишь к незначительному повышению итоговой концентрации ЯК в среде, при этомнаблюдается уменьшение продуктивности процесса по ЯК в 1,2 раза.
Вероятно, чрезмерновысокие концентрации глюкозы оказывают ингибирующий эффект на внутриклеточныеметаболические процессы, связанные с синтезом ЯК. В связи с этим в качестве оптимальнойдля получения ЯК в процессе культивирования свободных клеток A. succinogenes былавыбрана исходная концентрация глюкозы в среде - 50 г/л, при этом длительность процессаполучения максимальной концентрации ЯК составила 30 ч.116Рисунок 33 – Кинетика потребления глюкозы (черные символы) и накопления в среде ЯК(белые символы) в процессе культивирования свободных клеток A.
succinogenes приразличной концентрации исходной концентрации глюкозы в среде: 50 (●, ○) и 70 (▲, Δ) 100(♦, ◊) г/лТаблица 20 – Характеристики процесса получения ЯК под действием свободных клетокбактерий A. succinogenes (3,0 г сух. в-в/л)Исходная концентрация глюкозыСГЛ0, г/лДлительность получения СЯК макс, чМаксимальная концентрация ЯКСЯК макс, г/лПродуктивность процесса по ЯКQЯК, г/л/чПотребление глюкозыΔ СГЛ, %Степень конверсии потребленнойглюкозы в ЯКYЯК/ГЛ507010030354035,1±1,238,2±1,639,5±1,81,17±0,041,09±0,050,99±0,0499,0±1,078,0±2,156,4±1,70,71±0,020,70±0,020,70±0,02Анализ полученных результатов показал, что возможно эффективное использованиеклеток бактерий, предварительно выращенных до конца логарифмической фазы роста ипомещенных в высокой концентрации в среду для культивирования. Однако, несмотря на117проявленную свободными клетками высокую продуктивность, стадия отделения биомассыот культуральной жидкости для замены среды в реакторе и последующее получение хорошоресуспендированных и равномерно распределенных клеток в среде всегда трудоемко иэкономически нецелесообразно, поэтому ряд исследователей предпочитают однократноиспользовать свободные клетки в процессе.Очевидно, что более эффективным применение сконцентрированных клеток впроцессе получения ЯК может быть реализовано через их иммобилизацию.3.3.2.2 Разработка биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель ПВС клетокбактерий A.
succinogenes В-10111и исследование его свойств3.3.2.2.1 Оптимизация состава ИБК на основе клеток бактерий A. succinogenes,включенных в криогель ПВСИзвестно,чтоиммобилизациябактериальныхклетокпозволяетравномернораспределить их по всему объему реактора, удержать их в реакторе в высокой концентрациии снизить негативное влияние накапливающихся в процессе метаболитов, повысивстабильность функционирования [143, 199].В качестве носителя для иммобилизации клеток A. succinogenes был использованкриогель ПВС, который, как было указано ранее (см. гл. 3.1.2), хорошо зарекомендовал себяпри иммобилизации клеток различных микроорганизмов, успешно использованных вразнообразных биотехнологических процессах.Известно, что характеристики разрабатываемого ИБК в значительной степени зависятот удельного содержания в нем биомассы клеток [190].
Процесс “замораживанияоттаивания”, сопровождающий получение ИБК на основе клеток A. succinogenes,включенных в криогель ПВС, предполагает негативное воздействие низких температур наклетки, что может привести к частичной потере их жизнеспособности и, соответственно, кснижению уровня их метаболической активности. Для того чтобы при иммобилизациисохранитьвысокийуровеньжизнеспособностибактерий,исходнаяконцентрацияиммобилизуемых клеток не должна быть слишком низкой. С другой стороны, очень высокаяконцентрация клеток в составе гранул часто не всегда целесообразна, так как можетпроисходить вымывание клеток из носителя из-за их плохого удерживания.Концентрация полимера, используемого для получения ИБК на основе криогеля ПВС,такжеоказываетвлияниенаконечныехарактеристикиполучаемогопрепаратаиммобилизованных клеток [189].
В матрице с низкой концентрацией полимера (7–8%) из-забольшого размера образующихся пор клетки бактерий могут плохо удерживаться. Слишком118высокие концентрации полимера (более 13 – 15%) обеспечивают получение матриц с малымразмером пор, что может приводить к появлению диффузионных ограничений длямассообменных процессов и снижать метаболическую активность клеток [189].С учетом вышесказанного было проведено исследование влияния концентрации ПВСв растворе, используемом для иммобилизации клеток, и концентрации иммобилизуемойбактериальной биомассы на характеристики разрабатываемого биокатализатора.
Для этогобыли приготовлены (см. п. 2.2.2) образцы ИБК с различной концентрацией биомассы клетокA. succinogenes (от 1 до 3% по сухим веществам) на основе растворов, содержащих ПВС вразличных концентрациях (от 10 до 15%) (Таблица 21).Таблица 21 – Концентрация внутриклеточного АТФ (×10-7 моль/г сух. в-в) в суспензииклеток в растворе ПВС (до замораживания) и в «только что» сформированных гранулах ИБК(после размораживания), полученных при различной исходной концентрации раствора ПВС,использованногодляформированиягранул,иразличноммассовомсодержаниииммобилизуемой биомассы клеток в получаемой смесиПВС, %Биомасса,10%1315допоследопоследопосле14,8±0,23,9±0,24,0±0,13,4±0,13,7±0,23,0±0,128,7±0,37,8±0,47,7±0,36,7±0,37,1±0,45,9±0,3312,9±0,511,6±0,511,6±0,49,5±0,411,2±0,48,7±0,3Как видно из полученных результатов, концентрация внутриклеточного АТФ вгранулах с иммобилизованными клетками (после размораживания) повышалась сувеличениемсодержаниябиомассывэтихгранулах,чтосвидетельствовалообудовлетворительном уровне выживаемости клеток в процессе их иммобилизации в криогельПВС.
Варьирование же концентрации ПВС в составе ИБК в диапазоне от 10 до 15%практическинеоказываловлияниянауровеньметаболическойактивностииммобилизованных клеток, что выражалось в близких по величине значениях концентрациивнутриклеточного АТФ в составе гранул ИБК.Для исследования влияния состава ИБК на выход ЯК в процессе биотрансформацииглюкозы клетками A. succinogenes все образцы ИБК экспонировались в течение 34 ч впитательной среде того же состава, что использовалась для свободных клеток. Начальнаяконцентрация иммобилизованных клеток в среде во всех случаях была одинаковой и119составляла 3,0 г сух. в-в/л.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
