Свободные радикалы кислорода и антиоксиданты в митохондриях сердца и модельных системах (1104785), страница 3
Текст из файла (страница 3)
приведены результаты исследования зависимости скоростигенерации супероксидных радикалов изолированными митохондриями сердцакрысы от присутствия в среде инкубации адриамицина (доксорубицина) –эффективногопрепарата,противоопухолевогообладающего,однако,значительной кардиотоксичностью.Добавлениесредуадриамицинавприводилокинкубацииувеличению интенсивности сигналаЭПР от TIRON, т.е.
к заметномуростускоростисупероксидныхскоростиобразованиярадикалов.РостO2•–образованиянаблюдался во всем исследованномнамиинтервалеконцентрацииадриамицина (10-150 мкМ). В то жевремя,генерациядоступныхспиновым ловушкам супероксидныхрадикаловвблизиграницывнутреннеймембранысмежмембраннымпространствомвмитохондриях,модифицированныхадриамицином,почтиподавляласьполностьюстигмателлином–Рис. 4. Зависимость скорости образованиясупероксида в митохондриях сердцакрысы от добавок в реакционную смесь.Добавки в среду инкубации: сукцинат иантимицин A (1), сукцинат, антимицин Aи адриамицин (2), сукцинат, антимицин A,адриамицин и стигмателлин (3), сукцинати адриамицин (4). Условия инкубации: 10мин или 20 мин, температура ~25°C,концентрация адриамицина 50 мкМ.Кроме 3-4 (при 10-минутной инкубации),различия между образцами статистическидостоверны (P < 0.05).14ингибитором Q-цикла, блокирующим перенос электронов на Fe-S центр Риске.
Вотличие от стигмателлина, ротенон, блокирующий в комплексе I как обратный,так и прямой перенос электронов, не приводил в присутствии субстратов этогокомплекса (глутамата и малата) и адриамицина к полному исчезновению сигналаЭПР от TIRON.Показаны зависимости скорости генерации супероксидных радикалов визолированныхмитохондрияхсердцаотприсутствияадриамицинаиингибиторов дыхательной цепи в среде инкубации при использовании сукцината(субстрата окисления для комплекса II) (рис.
4) или при использованииглутамата и малата (субстратов окисления для комплекса I). Длительностьинкубации митохондрий в условиях непрерывной аэрации была в обоих случаяхравна 10 мин и 20 мин. Скорость образования O2•– возрастала, по сравнению сисходным уровнем, уже после десятиминутной инкубации в присутствииадриамицина.
Увеличение длительности инкубации до 20 мин вызывалонекоторый рост скорости образования супероксида во всех образцах, однако, неприводило к изменению общих закономерностей действия адриамицина. Вмитохондриях,модифицированныхадриамицином,скоростьгенерациисупероксидных радикалов всегда была выше, чем в митохондриях, в средеинкубации которых отсутствовал адриамицин. Эффект адриамицина наблюдалсятакже в опытах с митохондриями, выделенными либо после серии уколовадриамицина животным, либо после перфузии изолированного сердца вприсутствии адриамицина в среде для перфузии.В наших опытах in vitro на изолированных митохондриях сердцаадриамицин находился в среде инкубации и, благодаря специфическомувзаимодействию с кардиолипином, включался во внутренние мембраны этихорганелл. Находясь в митохондриях, редокс-активный адриамицин способенлибо непосредственно принимать электроны с переносчиков электронтранспортной цепи и передавать их молекулярному кислороду с образованиемсупероксидных радикалов, либо вызывать наблюдаемый в наших опытахзначительный рост скорости образования O2•– за счет изменения физико-15химических характеристик липидного окружения компонентов дыхательнойцепи.Вразделе3.5.представленыданныеизучениявзаимодействияцистеиновых ДНКЖ с супероксидом, генерируемым митохондриями сердцакрысы.
Представлены кинетики деструкции цистеиновых ДНКЖ (в мономернойпарамагнитной форме) в условиях образования супероксида комплексом IIIдыхательной цепи митохондрий (рис. 5). Деструкция ДНКЖ в присутствиимитохондрий, субстрата комплекса II сукцината и ингибитора антимицина Апроисходит существенно быстрее, чем в контроле.При добавление супероксиддисмутазы (СОД) скорость распада ДНКЖпрактически совпадает со скоростью в контроле. Этот факт доказывает, чтосупероксидный радикал влияет на распад ДНКЖ.
Следует отметить, чтозависимая от супероксида деструкция ДНКЖ наблюдалась в присутствииизбыткаявляющегосяцистеина,такжеантиоксидантом.Таким образом, ДНКЖ были болееэффективным«скавенджером»супероксида, чем цистеин. Можнопредположить, что ДНКЖ являетсядостаточноэффективнымпротектором, защищающим клеткуотспероксидныхисточникомрадикалов,которогоявляютсямитохондрии.Такжеприведеныданныеэкспериментов, где в присутствиицистеина, донора нитроксильногоаниона соли Ангели и ферритинапроисходит образование ДНКЖ. ВприсутствиемитохондрийиРис. 5. Деструкция цистеиновых ДНКЖ вусловияхгенерациисупероксида.(1)митохондрии сердца крысы, цистеиновыеДНКЖ; (2) митохондрии сердца крысы,цистеиновые ДНКЖ, сукцинат, антимицин A;(3) митохондрии сердца крысы, цистеиновыеДНКЖ, сукцинат, антимицин A, СОД.Инкубационная смесь в фосфатном буфере(рН=7,5), температура ~25°C.16сукцината, выход ДНКЖ, образующихся под действием нитроксильного аниона,существенно возрастал.Раздел 3.6.
посвящен изучению характеристик семихинонных свободныхрадикалов – промежуточных продуктов в окислительно-восстановительныхреакциях митохондриально-направленных антиоксидантов mitoQ, SkQ1 и SkQ3, атакже ряда их короткоцепочечных аналогов: CoQ1 (2,3-диметокси-5-метил-6-(3метил-2-бутенил)-1,4-бензохинона),CoQ0(2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензо-хинона), decyl PQ (2,3-диметил-6-децил-1,4-бензохинона), PQ0 (2,3-диметил-1,4бензохинона) и TMQ (2,3,5-триметил-1,4-бензохинона). Свободнорадикальныеинтермедиаты образовались в процессе автоокисления соответствующиххинолов в слабо-щелочной среде (pH 7,8-8,5), спектры ЭПР регистрировали вусловиях варьируемой оксигенации образца.Спектры ЭПР mitoQ и CoQ1 (рис.
6) имеют 9 компонент сверхтонкойструктуры и практически идентичны, вобоих случаях неспаренный электронвзаимодействует с тремя протонамиметильной группы при C5 и двумяпротонами метиленовой группы приC6хиноидногопротоны–CH3кольца.группыОднако,приC5вызывают почти в два раза большеерасщепление в спектре, чем протоны–CH2– группы при C6: a(3H) ≈ 0,19мТл, a(2H) ≈ 0,099 мТл. Это означает,что плотность неспаренного электронау атомов C5 и C6 также отличается вдва раза. Переход к CoQ0, т.е. замена–CH2– фрагмента на –H приводит кзначительномуэлектроннойперераспределениюплотностиуатомов17Рис. 6.
Экспериментальные спектрыmitoQ и CoQ1. Условия регистрацииспектров ЭПР: СВЧ мощность 0,5 мВт,амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл.хиноидного кольца: в спектре ЭПР теперь 8 компонент, при этом a(3H) ≈ 0,236мТл, a(1H) ≈ 0,197 мТл.Спектры ЭПР SkQ1 и decyl PQ (рис. 7) характеризуются взаимодействиемнеспаренного электрона с девятью магнитно практически эквивалентнымипротонами (–CH3 группы при C2 и C3, –CH2– группа при C6 и –H группа приC5) хиноидного кольца. В спектрах ЭПР семихинонов обоих соединений 10компонент, a(9H) ≈ 0,18 мТл. Таким образом, в молекулах SkQ1 и decyl PQэлектронная плотность одинакова у атомов углерода C1-C6 хиноидного кольца.Однако, переход к PQ0, т.е.
замена –CH2– фрагмента алифатической цепи на –HРис. 7. Экспериментальные спектрыSkQ1 и decylPQ. Условия регистрацииспектров ЭПР: СВЧ мощность 0,5мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,05мТл.Рис. 8. Экспериментальные спектрыSkQ3 и TMQ. Условия регистрацииспектров ЭПР: СВЧ мощность 0,5мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,05мТл.приводит к значительному перераспределению электронная плотности у атомовхиноидного кольца: в спектре ЭПР теперь 17 компонент, при этом a (6H) ≈ 0,18мТл, a (1H) ≈ 0,27 мТл.18Спектр ЭПР анион-радикала SkQ3 (рис. 8) (в хиноидном кольце протон уC5 заменен на метильную группу) значительно сложнее, чем анион-радикалаSkQ1.
В отличие от SkQ1, неспаренный электрон в SkQ3 распределеннеоднородно по углеродам хиноидного кольца. Протоны –CH3 групп при C2, C3и C5 вызывают в два раза большее расщепление в спектре, чем протоны –CH2–группы при C6. В случае SkQ3 в спектре ЭПР 21 линия (из них 4 крайние оченьмалой интенсивности), a(9H) ≈ 0,18 мТл, a(2H) ≈ 0,9 мТл. Таким образом,параметры сверхтонкой структуры спектров ЭПР mitoQ, SkQ1, SkQ3 и ихкороткоцепочечных аналогов (Q0 и PQ0) четко показывают, что семихинонывсех указанных соединений существуют преимущественно в форме анионрадикалов, которые могут быть стабилизированы при наличии подходящегоокружения благодаря образованию водородных связей.Проведено исследование влияния среды инкубации с другой полярностью– DMSO (диметилсульфоксида) – на спектры ЭПР семихинонов, возникающихпри окислении SkQ1, mitoQ, PQ0 и Q0.
Общие характеристики спектров ЭПРанион-радикалов всех исследованных соединений в DMSO сохраняются, приэтом происходит небольшое изменение среднего значения g-фактора. Несколькоизменяется и распределение электронной плотности по углеродным атомам (C2,C3, C5 и C6) хиноидного кольца, что приводит к дополнительному расщеплениюлинийсверхтонкойструктурыспектровЭПР.Следуетотметить,чтоиспользование DMSO в качестве растворителя приводит к стабилизациисвободнорадикальных интермедиатов SkQ1 и mitoQ, однако практически невлияет на кинетику образования и гибели свободных радикалов их аналогов PQ0и Q0.Приведены результаты исследования зависимости кинетики образования игибели свободнорадикальных форм SkQ1, mitoQ и Q0, образовавшихся приавтоокислении их восстановленных форм, от парциального давления кислородав среде инкубации (этанол-вода). В этих опытах реакционная смесь находилась врезонаторе спектрометра ЭПР в газопроницаемых капиллярах, а содержаниекислорода в газовой среде варьировалась от 2% до 21% (атмосферный воздух).Семихиноны SkQ1, mitoQ и Q0 образовывались при всех использованных19концентрациях кислорода в среде инкубации, однако квазистационарнаяконцентрация их свободнорадикальных форм зависела существенным образомот содержания кислорода в среде.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
