Свободные радикалы кислорода и антиоксиданты в митохондриях сердца и модельных системах (1104785), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Объем работы составляет 117 страниц, включая 32рисунка и библиографию из 163 наименований.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении дана общая характеристика диссертационной работы.Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования,изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.Первая глава содержит литературный обзор, посвященный физикохимическим характеристикам активных форм кислорода и азота, их источникамв организме и роли в процессах жизнедеятельности. Существенное вниманиеуделено вопросам участия свободных радикалов кислорода и токсичныхметаболитов оксида азота в возникновении и развитии повреждений клетоксердечной мышцы при патологическом стрессе, обусловленным нарушениямикислородного обмена в условиях гипоксии и ишемии.
Изложены современныепредставления о механизмах действия адриамицина (доксорубицина) – одногоиз наиболее часто применяемых лекарственных препаратов при химиотерапиизлокачественныхопухолейчеловека.Показано,чтотерапевтическоеикардиотоксическое воздействия адриамицина представляют собою единыймультифакторный процесс, обусловленный окислительным стрессом. Проведенанализ современных тенденций способов защиты организма от последствийокислительного стресса, обоснована целесообразность поиска и исследованияхарактеристик митохондриально-направленных антиоксидантов, в молекулахкоторых сочетались бы положительно заряженные гидрофобные группы иредокс-активные хиноны, такие как убихинон или пластохинон.Во второй главе представлены методы и материалы исследования.
Вразделе 2.1. описано получение изолированных митохондрий из сердец крыслинии Wistar по (Hogeboom, 1955), в разделе 2.2. – измерение их дыхательнойактивности с помощью электрода Кларка на полярографе YSI 53 фирмы YellowSpring Instruments, Inc. (США), а также с помощью нитроксильного радикалаTEMPONE-D-15N(4-оксо-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-D16-1-оксил-15N)наспектрометре ЭПР. Для этого суспензию митохондрий помещали в герметично9закрытый стеклянный капилляр при температуре образца ~25°C.
В разделах 2.3. и2.4. описываются методики регистрации и обработки спектров ЭПР. СпектрыЭПР регистрировали на спектрометре E-109E фирмы Varian (США) прикомнатной температуре (~25°C). Образцы помещали в газопроницаемыекапилляры PTFE 22 (внутренний диаметр 0.635 мм, толщина стенок 0.051 мм)фирмы Zeus Industrial Products, Inc.
(США), а запись спектров проводили либопри непрерывной аэрации образца (газовая среда – воздух), либо в условияхварьируемого парциального давления кислорода. Содержание кислорода винкубационной смеси определяли по ширине компонент спектра ЭПРTEMPONE-D-15N, а также по ширине синглетного сигнала ЭПР фталоцианиналития (LiPc). Для измерения скорости генерации супероксидных радикалов вмитохондриях или в модельных системах в реакционную смесь вводилиспиновуюловушкуTIRON(4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонатнатрия).Абсолютные значения скорости образования O2•– вычисляли с помощьюсупероксид-генерирующей системы ксантиноксидаза-ксантин, кинетическиехарактеристики которой определяли по скорости восстановления цитохрома cсупероксиднымиполучениярадикалами.препаратовРаздел2.5динитрозильныхпосвященописаниюметодовкомплексовжелеза(ДНКЖ),используемых в экспериментах по изучению метаболизма оксида азота ибаланса прооксидантных и антиоксидантных процессов в клетках миокарда.Концентрацию ДНКЖ в образцах также определяли с помощью спектроскопииЭПР.
Для этого используемую димерную форму ДНКЖ, не обнаруживаемуюметодом ЭПР, переводили в мономерную ЭПР-детектируемую форму. В разделе2.6. описаны методики получения и изучения характеристик семихинонныхсвободныхрадикалов–промежуточныхпродуктоввокислительно-восстановительных реакциях биологически значимых хиноидных соединений –производных убихинона или пластохинона. Семихиноны mitoQ (2,3-диметокси5-метил-6-децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинон),децилтрифенилфосфоний-1,4-бензохинон),SkQ3SkQ1(2,3-диметил-6-(2,3,5-триметил-6-децилтри-фенилфосфоний-1,4-бензохинон) и их аналогов образовались в процессеавтоокисления соответствующих хинолов в этаноле или в смеси этанол-водный10буфер (pH 7,8-8,5).
Все экспериментальные спектры свободнорадикальныхинтермедиатов были симулированы с помощью программы WinEPR SimFoniaфирмы Bruker (ФРГ).Статистическую обработку полученных результатов производили по tтесту и тесту ANOVA. Результаты представлены как среднее значение ± средняяошибка (M±m). Различия между экспериментальными данными считалидостоверными, если P < 0,05.В третьей главе представлены полученные результаты и их обсуждение.В разделе3.1. представлены результаты определения функциональнойактивности митохондрий.
Для этого измеряли скорости потребления кислорода втретьем и четвертом состояниях дыхательной цепи с помощью электродаКларка,атакжеснитроксильногопомощьюрадикалаTEMPONE-D-15N на спектрометреЭПР, ширина линий дублетногоспектракоторогоконцентрациейопределяетсякислородавреакционной смеси (рис. 1). Внашихопытахмитохондрииизолированныесердцакрысыхарактеризовались в состояниях 3и 4 скоростями дыхания 77±9 и26±5нмольO2/мин/мгсоответственно(прибелка,25°C),т.е.имели дыхательный контроль поADP, равный по значению четырем.В разделе 3.2. представленырезультаты по измерению скоростейгенерации супероксидных радикаловизолированнымимитохондриямиРис.
1. Зависимость ширины низкопольнойкомпоненты спектра ЭПР нитроксильногорадикала TEMPONE-D-15N в суспензиимитохондрий сердца крысы от времениинкубации.Суспензиямитохондрийнаходилась в закупоренном стеклянномкапилляре при температуре образца ~25°C.Добавки в инкубационную смесь: сукцинат,ротенон и ADP (1, 4), сукцинат и ротенон(2), без добавок (3). Концентрация белка: 0.5мг/мл (1-3); 5 мг/мл (4).11сердца. Было показано, что регистрация с помощью спектроскопии ЭПРкинетики супероксид-зависимого окисления TIRON в свободные радикалы(семихиноны) TIRON•– является удобным и достаточно чувствительным методомизмерения скорости образования супероксида электронными переносчикамимитохондрий в условиях контролируемой оксигенации образца. В отсутствииингибиторовскоростьсукцинат-зависимогообразованиясупероксидныхрадикалов в комплексе III (bc1 сегменте) была мала (~0.01 нмоль O2•–/мин/мгбелка при 25°C), однако, в присутствии антимицина A, блокирующего переносэлектронов от цитохромов b на окисленный коэнзим Q, сильно возросла (до 0.81.2 нмоль O2•–/мин/мг белка).
В то же время, генерация O2•– в комплексе IIIполностью подавлялась миксотиазоломи стигмателлином – ингибиторами Qцикла,блокирующимипереносэлектронов на Fe-S центр Риске. Прииспользованииглутаматаималата(субстратов комплекса I) добавлениеантимицина A в среду инкубации такжесопровождалось усиленной генерациейO2•– в комплексе III дыхательной цепи.В то же время, добавление ротенона,блокирующегообратный,втакэлектронов,комплексеипрямойнеIкакпереносприводилоприиспользовании глутамата и малата квозникновениюсигналаЭПРсемихинона TIRON.Раздел3.3.посвященисследованию влияния гипоксии разнойдлительностиипоследующейреоксигенации на скорость образованиясупероксидныхрадикаловв12Рис.
2. Спектры ЭПР спиновойловушкиTIRONвсуспензиимитохондрий сердца крысы. Добавки винкубационную смесь: сукцинат иантимицин A. Газовая среда врезонаторе: воздух (1, 4, 5), азот (2, 3).Спектры записаны в следующихусловиях: 8 мин в воздухе (1); 10 мин ввоздухе, 10 с (2) и 4 мин (3) в азоте; 10мин в воздухе, 10 мин в азоте, 10 с (4) и4 мин (4) в воздухе.изолированных митохондриях сердца. Представлены спектры ЭПР TIRON всуспензии митохондрий, генерирующих супероксид в присутствии субстратовдля комплексов I или II (малат-глутамат или сукцинат) и антимицина A.
Переходиз аэробных условий в условия гипоксии (смена газовой среды с воздуха на азот)сопровождалсяпадениемобразовавшихсявинтенсивностирезультатеокислениясигналасемихиноновспиновойловушкиTIRON,TIRONсупероксидными радикалами. Реоксигенация, в свою очередь, приводит кбыстромувозрастаниюсигналаTIRON•–, причемскоростьобразованиясупероксидных радикалов окажется больше, чем до гипоксии (рис.
2).На рис. 3 показана зависимость скорости генерации супероксидныхрадикалов изолированными митохондриями от длительности гипоксии прииспользовании субстратов дыхания комплексов I и II. Длительность гипоксиибыла в обоих случаях 10 мин и 30мин. Скорость образования O2•–возрастала,посравнениюсконтрольным уровнем, уже после10-минутнойгипоксии,увеличениеоднако,длительностигипоксиинеприводилосущественнымкизменениям.Интенсивность сигнала ЭПР отTIRON после 30 или 45 мингипоксии была практически такойже,какипосле10-минутнойгипоксии.Таким образом, гипоксия ипоследующаяреоксигенациясопровождаетсяизменениямиизолированныхопределеннымивмембранахмитохондрийсердца, вызывающими увеличениеРис.
3. Зависимость скорости образованиясупероксида в суспензии митохондрийсердца крысы от субстратов окисления идлительностигипоксии.Добавкивинкубационнуюсмесь:сукцинатиантимицин A (светлосерые столбики);глутамат,малат,иантимицинA(темносерые столбики). Условия инкубации:10 мин в воздухе (1); 10 мин в воздухе, 10мин в азоте, 10 мин в воздухе (2); 10 мин ввоздухе, 30 мин в азоте, 10 мин в воздухе(3). Температура образца: ~25°C.13скорости образования O2•– электронными переносчиками (семихинонамикоэнзима Q) комплекса III дыхательной цепи. Однако, в отличие отмитохондрий, выделенных из сердец после ишемии-реперфузии, величинаэффекта не зависела от длительности гипоксии. Полученные данные позволяютзаключить, что изолированные митохондрии сердца, находящиеся в средеинкубации, характеризуются большей невосприимчивостью к гипоксии, чеммитохондрии в клетках сердечной мышцы, подвергнутой ишемии.В разделе 3.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
