Особенности межмолекулярного взаимодействия молекул коллагена в водных растворах (1104135), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Этот процесс может происходить, когда поверхностный заряд на белкеминимален. При этом возможно взаимодействие между молекулами за счет сил Вандер-Ваальсого притяжения, в результате чего эффективная масса молекул коллагена10увеличивается.При рН 4.2, полученное значение эффективной массы молекулы коллагена:Мэфф=297000 г/моль близко к литературному значению: Млит=340000 г/моль.Дляопределенияизоэлектрическойточкиколлагенабылиполученызависимости коэффициента межмолекулярного взаимодействия и коэффициентдеполяризации от рН в водных растворах (рис.2,3).
Экстремумы этих зависимостейсвязаны с минимизацией суммарного поверхностного заряда на молекулах белка иопределяют изоэлектрическую точку коллагена – рН 6.0.Глава 6 содержит описание экспериментального исследования водныхрастворов коллагена, содержащих ионы легких и тяжелых металлов - Ca2+, Na+, K+,Pb2+, при различных значениях показателя рН среды методом динамическогосветорассеяния.
Глава включает в себя несколько разделов и пунктов.В разделе 6.1 дано описание фотонно-корреляционного спектрометра.ИсточникомсветавустановкеслужитHe-Neлазер,дающийлинейно-поляризованный свет. Луч от лазера с помощью 90°-призмы попадает в кювету собразцом. Рассеянный под углом 90° свет регистрируется при помощи ФЭУ, затемсигнал подаётся на коррелятор, соединенный с компьютером. Данная системапозволяет проводить измерения при различных углах рассеяния и температурах.Температура устанавливается с помощью термостата, регулируемого компьютером.В разделе 6.2 описываются динамические свойства молекул коллагена вводных растворах с добавлением различных солей (CaSO4, NaCl,KCl иPb(CH3COO)2).
Кратко описывается схема приготовления образцов и расчет ионнойсилы растворов.В пункте 6.2.1 представлены результаты экспериментального исследования.Было обнаружено, что зависимость коэффициента трансляционной диффузиимолекул коллагена от показателя pH в чистом водном растворе и в растворах сдобавлением солей CaSO4 и NaCl имеет нелинейную зависимость с максимумомвблизи изоэлектрической точки – pH 6.0 (рис.4). Справа и слева от изоэлектрическойточки коэффициент трансляционной диффузии уменьшается.11-92Dt*10 , см /с12Рис.4Зависимостькоэффициента10трансляционной диффузии Dt коллагена отпоказателя рН: в чистом водном растворе81(кривая 1), с добавлением соли CaSO46(кривая 2), с добавлением соли NaCl24(кривая 3), ионная сила растворов µ=10-332моль/л.pH03,54,04,55,05,56,06,57,07,58,0Совершенно противоположные зависимости наблюдаются в случае добавлениив раствор коллагена солей KCl и Pb(CH3COO)2 (рис.
5,6). Видно, что значение ионнойсилы растворов влияет на величину коэффициента Dt, он уменьшается с ростомконцентрации ионов калия и свинца.-10-102Dt*10 , см /с322Dt*10 , см /с24128124232016 2320161212884404,0Рис.54,55,0Зависимость5,56,06,5коэффициентаpH7,0Dt03,5Рис.6pH4,04,55,0Зависимость5,56,06,5коэффициента7,0Dtколлагена от показателя рН для водныхколлагена от показателя рН для водныхраствороврастворов коллагена с добавлением соликоллагена с добавлением солиKCl.Pb(CH3COO)2.(для трех ионных сил раствора: µ=10-4 моль/л – кривая 1, µ=10-3 моль/л – кривая 2,µ=10-2 моль/л – кривая 3);12Пункт 6.2.2 посвящен обсуждению полученных результатов.При исследовании динамических параметров молекул коллагена былополучено, что при добавлении в раствор ионов Ca2+ и Na+, имеющих небольшойионный радиус (RCa2+=0,99Ǻ, RNa+=0,8Ǻ), наблюдается нелинейная зависимостькоэффициента Dt с максимумом в области изоэлектрической точки (рН~6.0), так жекак и в чистом водном растворе белка (рис.4).
Справа и слева от изоэлектрическойточки коэффициент трансляционной диффузии уменьшается, поскольку белокприобретает либо положительное либо отрицательное значения суммарногоповерхностного заряда.В соответствии с формулой:Dt = Do {1 + (2 BM − [η ])c} коэффициенттрансляционной диффузии белка должен уменьшаться, если его характеристическаявязкостьпревышаетпроизведениемассымолекулынакоэффициентмежмолекулярного взаимодействия. Действительно, характеристическая вязкостьколлагена (1150 см3/г) более чем на два порядка выше, чем вязкость такихглобулярных белков как, например, альбумина (3,7 см3/г).
Ранее в нашей лабораториибыло показано, что в водных растворах альбумина и гамма-глобулина коэффициенттрансляционной диффузии Dt имеет минимум в изоэлектрической точке, а немаксимум, как в растворах коллагена. Это определяется тем, что для этих белковпроизведение BM (формула выше) имеет бóльшую величину по сравнению скоэффициентом характеристической вязкости [η]. Величина В увеличивается с ростомзаряда на белке, что и определяет рост коэффициента трансляционной диффузии. Дляколлагена модуль разности (2BM - [η]) уменьшается с ростом заряда, что приводит куменьшению Dt по сравнению с его значением в изоэлектрической точке.Характер зависимости коэффициента Dtколлагена резко меняется придобавлении в раствор солей KCl и Pb(CH3COO)2 – вместо максимумарН –зависимости Dt , наблюдается минимум (рис.
5,6). Это указывает на влияние сильныхэлектростатических взаимодействий между ионами и молекулами белка. Наличие врастворе ионов с большим ионным радиусом приводит к преобладанию сил диполь–дипольного взаимодействия между молекулами белка по сравнению с силамикулоновскогоотталкиванияиобразованиюмакромолекулярныхкомплексов(кластеров) вблизи изоэлектрической точки. На рисунках 5,6 видно, что с ростом13ионной силы µ раствора коэффициент трансляционной диффузии уменьшается.
Этоуказывает на то, что с увеличением концентрации ионов K+ и Pb2+ в растворах массарассеивающих частиц также растет.Если сравнить полученные значения коэффициента трансляционной диффузиив чистом водном растворе коллагена и в растворах с добавлением различных ионов Ca2+, Na+ , K+, Pb2+ при одном и том же значении pH (табл.1), то можно увидеть, что сростом ионных радиусов коэффициент Dt уменьшается.ИОНЫRион (Å)H2OCa2+Dt*10-9 (см2/с)11,20,9910,5Na0,87,1K+1,330,73Pb2+1,20,45+Табл.1Значениякоэффициентов Dt молекулколлагенавводныхрастворах, содержащих солиметалловсразличнымиионными радиусами(ионнаясиларастворов:µ=10-3 моль/л; рН=5.5).Значения коэффициентов трансляционной диффузии вчистом водномрастворе коллагена и в растворах с ионами кальция и натрия имеют значения почтина два порядка больше, чем в растворах, содержащих ионы калия и свинца, что такжесвидетельствует об образовании крупных частиц в растворах.Раздел 6.3 содержит результаты, полученные при исследовании угловойзависимостиинтенсивности рассеянного света в водных растворах коллагена спомощью динамического метода при добавлении различных солей (NaCl,Pb(CH3COO)2).KCl иКратко дается характеристика исследуемых растворов и порядокэксперимента.В пункте 6.3.1 описываются результаты эксперимента, представленные в видезависимостей интенсивности рассеянного света в чистом растворе коллагена и сдобавлением солей калия, натрия и свинца при трех углах: 450, 900, 1350.
Дляполучения полезной информации о белке-коллагене, а именно – размерах и формерассеивающих частиц, необходима была проведена обработка экспериментальных14данных с помощью методов асимметрии и двойной экстраполяции.В пункте 6.3.2 описаны методы обработки экспериментальных данных(методы асимметрии и двойной экстраполяции).А. В методе асимметрии рассчитывается значение характеристическойасимметрии избыточного рассеяния: |Z|=(I45º/I135º)c=0, которое обычно определяетсяграфической экстраполяцией к с=0 величины 1/ (Z-1) по измерениям рассеяния врастворах5-8убывающихконцентрациях.Повеличине|Z|,пользуясьсоответствующей таблицей или графиком, можно определить относительные размерычастиц в растворе, а также фактор рассеяния Pv(90º), необходимый для вычислениямолекулярного веса.Б.
Зиммом был предложен метод интерпретации данных светорассеяния,получивший название метода двойной экстраполяции. Следуя этому методу,измеряют IΘv для ряда концентраций и различных углов рассеяния Θ, а затем строятΘграфик зависимости величины cH/IΘv от сложного аргумента (sin2 2 +kc). Иногдаиспользование метода двойной экстраполяции в его обычном виде затруднительно (вчастности, для весьма больших молекулярных весов), поэтому в данной работеиспользовался видоизмененный метод двойной экстраполяции для вычисленияразмеров и формы частиц.В пункте 6.3.3 представлены результаты, полученные при обработке спомощью методов асимметрии и двойной экстраполяции.Ниже (табл.2) приведены табличные значения (Цветков В.Н., Эскин В.Е.,Френкель С.Я. “Структура макромолекул в растворах”) и экспериментальныеданные, полученные из обработки эксперимента с помощью метода асимметрии:151.ВчистомводномраствореD=2215 Å- размер частицы;Pv (90°)= 0,776.коллагена:|Z|эксп=1,277;|Z|теор=1,279.D=1898 Å – относительный размер3.
В водном растворе коллагена счастицысолью KCl:(внашемслучае,предполагаемая длина);|Z|эксп=3;Pv (90°)=0,83 - фактор рассеяния.D=3797 Å - размер частицы; Pv(90°)=Форма молекулы – палочка.0,34.Для сравнения: для сферических частицФорма молекулы – клубок.идеальной формы: Pv (90°)=1.4. В водном растворе коллагена с|Z|теор=3,06.солью Pb(CH3COO)2:2. В водном растворе коллагена с|Z|эксп=3,2 ;солью NaCl:D=4113 Å; Pv(90°)= 0,3.Z|эксп=1,35;|Z|теор=3,303.Форма молекулы – клубок.|Z|теор= 1,372 .Форма молекулы – палочка.|Z|теор|Z|экспPv (90°)ФормачастицыРазмерчастицы,ÅВ чистом водномраствореколлагена1,2791,2770,83палочка1898С солью NaCl1,3721,350,776палочка2215С солью KCl3,0630,34клубок3797С сольюPb(CH3COO)23,3033,20,3клубок4113Табл.2 Формы и размеры частиц в водных растворах коллагена, рассчитанные спомощью метода асимметрии.16По результатам, полученных с помощью метода двойной экстраполяции, былирассчитаны относительные размеры частиц в водных растворах коллагена с солямиKCl и Pb(CH3COO)2 (в данном случае клубков, как было определено методомасимметрии):1.
В растворах коллагена с солью KCl :<R>2/λ2=0,17; R=2830 Å – относительный размер частиц.2. В растворах коллагена с солью Pb(CH3COO)2 :<R>2/λ2=0,15; R=2451 Å – относительный размер частиц.Пункт 6.3.4. посвящен обсуждению полученных результатов.Из данных (табл.1), полученных при обработке методом асимметрии, следует,что в чистых водных растворах коллагена и в растворах с солью NaCl частицы имеютстержнеобразную форму с размером около ~ 2000 Å (предполагаемая длина). Врастворах с солями KCl и Pb(CH3COO)2 частицы становятся крупнее и приобретаютформу клубка с размером ~ 4000 Å. Как мы предполагаем, это форма соответствуетобразующимся в растворах кластерам, составленным из молекул коллагена.С помощью видоизмененного метода двойной экстраполяции полученыразмеры частиц белка в водных растворах с солями KCl и Pb(CH3COO)2: 2830 Å и2450 Å соответственно. Предполагаемая форма частиц в данном случае – клубки.В разделе 6.4 описывается исследование температурных зависимостейкоэффициента трансляционной диффузии молекул коллагена в водных растворахметодом динамического светорассеяния.В пункте 6.4.1 представлены результаты экспериментального исследованияводных растворов коллагена в диапазоне температур от 23 до 50ºС при пятиразличных концентрациях (рис.8).
На рис.9 изображена температурная зависимостькоэффициента трансляционной диффузии для водного раствора коллагена с сольюPb(CH3COO)2 в области изоэлектрической точки белка (рН 5.8).17-92-9Dt*10 , см /с2Dt*10 , см /с6,53,56,03,05,55,0c12,54,54,0c23,5c32,03,0c41,52,5c52,002025Рис.83035Зависимостьтрансляционнойтемпературыколлагена45водных53050Рис.9коэффициентаDtдиффузиидляпри400T, C1,0T, Cот3540температурыконцентрациях.50Зависимость коэффициентатрансляционнойрастворов45коллагенадиффузиидлясводногоDtотрастворадобавлениемсоли(с1=0.055мг/мл,с2=0.11мг/мл,Pb(CH3COO)2с3=0.165мг/мл,с4=0.22мг/мл,(µ=10-4 моль/л, с=0.055 мг/мл, pH 5.8).с5=0.275мг/мл)Пункт 6.4.2. посвящен обсуждению полученных результатов.Характерзависимостикоэффициентатрансляционнойдиффузииоттемпературы (рис.8) для водных растворов коллагена (при 5 концентрациях) имеетхарактерный минимум в области 37оС.Областьтемпературот24оСдо37оСхарактеризуетсяпостепеннымуменьшением коэффициента диффузии с ростом температуры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
