Диссертация (1103954), страница 21
Текст из файла (страница 21)
раздел 3.2.2.1).*103������b����a���[� �]s���[��]s����s�����������[� �]����������= −�7 [� �]� + �−7 [� �]s − �1 �� + �−1 �b − �6 �� + �−6 �s ,�4 �b [��]s�4 � b �−,�4 + �b + [��]s �4 + �b + ��4 �b [��]s�4 � b �= �2 � b ++,�4 + �b + [��]s �4 + �b + ��9 [� �]s �a= �7 [� �]� − �−7 [� �]s + �8 � �s − �−8 [� �]s −,�9 + [� �]s + �a�9 [� �]s �a=,�9 + [� �]s + �a= �1 �� − �−1 �b − �2 �b −= �6 �� − �−6 �s − �8 � �s + �−8 [� �]s ,(3.1.3)= −�5 � � + �−5 [� �] − �6 �� + �−6 �s ,= −�1 �� + �−1 �b ,= �5 � � − �−5 [� �] − �7 [� �]� + �−7 [� �]s ,=�3 � � a,�3 + � + � a= −�5 � � + �−5 [� �] −�3 � �a− �8 � �s + �−8 [� �]s ,�3 + � + � aудовлетворяющих следующим уравнениям сохранения:� + � + [� �] + [� �]s + [��]s = �0 , � + �s + [� �] + [� �]s + [��]s = �0 ,� + �b + �a + �s + [� �]s + [��]s = �0 , � + �b + �a = �0 .(3.1.4)(3.1.5)где �0, �0, �0 и �0 — начальные концентрации PK, HMWK, сайтов связывания и FXIIсоответственно.Важно отметить, что константы Михаэлиса �4 и �9 зависят от размеров компартментов.Их значения заданы выражениями:�4 = �� 4 , �9 = �� 9 .Экспериментальные кривые, полученные как в [17], так и в [18], имеют характерную куполообразную форму.
Максимальная концентрация калликреина к концу эксперимента наблюдается для концентраций ЛПС равной ∼ 180 мкг/мл в отсутствие HMWK (рис. 3.15 A)и ∼ 20 мкM (рис. 3.15 B) в системе с HMWK. Далее эти концентрации мы будем называтьоптимальными. Концентрации ЛПС больше оптимального значения ведут к уменьшениюнаблюдаемой активности калликреина. Чтобы описать такое поведение системы, мы выполнили оценку неизвестных параметров наших математических моделей 3.1.1 и 3.1.3, варьируя104кинетические константы �i, �i, �i и начальную поверхностную концентрацию доступныхсайтов связывания � 0 (см. раздел 4 главы 2).
Основным параметром, используемым для валидации модели и выбора параметров, была наблюдаемая концентрация калликреина в концеэксперимента. В случае модели (3.1.1), весь калликреин присутствует в растворенном видеи его наблюдаемая концентрация совпадает с его объемной концентрацией. В случае модели (3.1.3), наблюдаемая концентрация калликреина определяется объемной концентрациейсвободного калликреина и поверхностной концентрацией комплекса [Kr, HMWK] относительно объема раствора:�obs = � + [��]s .(3.1.6)3.2Результаты моделированияРезультаты подборки параметров в модели 3.1.1 для воспроизведения кривой из работы [17]и в модели 3.1.3 — для воспроизведения данных из работы [18], приведены на рис.
3.15 Aи рис. 3.15 B соответственно. Значения параметров модели приведены в табл. 2.1 раздела 4главы 2.Рис. 3.15: Наблюдаемая концентрация калликреина (�obs) к концу времени экспериментадля разных значений концентрации ЛПС. Кривая соответствует результатам моделирования,точки — экспериментальным данным. A. Результат подбора параметров в модели 3.1.1 длявоспроизведения экспериментальных данных [17] (2400 с).
B. Результат подбора параметровв модели 3.1.3 для воспроизведения экспериментальных данных [18] (1800 c). В [17] ЛПС иFXII были инкубированы в течение 20 мин до добавления в систему PK. Концентрации ЛПСна графике (A) соответствуют таковым для финальной системы.1053.2.1Роль агрегатного состояния ЛПССуществование оптимальной концентрации ЛПС можно объяснить ролью поверхностныхэффектов в реакциях контактной активации. Действительно, основные реакции рассматриваемого процесса происходят на поверхности агрегатов ЛПС и, следовательно, сильно зависят от концентрации доступных сайтов связывания.
Высокая концентрация ЛПС приводитк эффекту поверхностного ингибирования, то есть способствует быстрому связыванию всехрастворенных факторов на поверхности агрегатов и, таким образом, предотвращает взаимодействие связанных факторов с белками плазмы, а также друг с другом. Эту гипотезуможно проверить с помощью разработанных математических моделей.Рис. 3.16: Изменение объема доступного для контакта с ЛПС-агрегатами раствора при изменении концентрации ЛПС.Чтобы воспроизвести экспериментальные результаты, полученные в [17] и [18], необходимо предположить, что ЛПС присутствуют в растворе в виде агрегатов. Действительно,при этом предположении увеличение концентрации ЛПС приводит к увеличению площади поверхности агрегатов ЛПС по отношению к имеющемуся объему раствора (рис.
3.16).В терминах математических моделей это соответствует уменьшению компартмента�sol ,со-ответствующего объему раствора, приходящегося на один агрегат ЛПС, и к увеличениюкоэффициента преобразования�(см. раздел 3.1). В результате, начальная объемная кон-центрация доступных сайтов связывания, определяемая выражением�(0) = ��(0), увеличи-вается, и для малых концентраций ЛПС наблюдается увеличение активности калликреинаиз-за увеличения скорости поверхностных реакций. В то же время, количество растворенных факторов, участвующих в поверхностных реакциях активации, уменьшается при малыхзначениях�sol ,и мы наблюдаем экспериментально описанный эффект поверхностного инги-бирования (рис. 3.17, сплошные линии).Такой эффект не может быть воспроизведен, если мы предположим, что ЛПС участвуетв реакциях активации в растворенном виде. Действительно, если мы будет воспроизводить106увеличение концентрации ЛПС путем простого увеличения концентрации доступных сайтов связывания (� 0 ), то результаты моделировании будут отличаться от экспериментальнонаблюдаемого поведения системы.
Увеличение концентрации сайтов связывания для фиксированных объемов компартментов приводит к монотонному увеличению активности калликреина до его максимального значения (рис. 3.17, пунктирные линии). Таким образом,можно сделать вывод, что в рассматриваемой системе ЛПС образуют агрегаты и обеспечивают активирующую поверхность для реакций контактной системы.Рис.
3.17: Наблюдаемая концентрация калликреина на момент окончания экспериментовмодели 3.1.1 (� , A) и модели 3.1.3 (�obs , определяемая (3.1.6), B) как функции объемнойконцентрации сайтов связывания на ЛПС агрегатах. Объем раствора на один агрегатбыл равен7.47 мкм3для модели (3.1.1) (A) иплощадь поверхности агрегата�lpsцентрация сайтов связывания�0и до1248835 мкм−2связывания�00.02 мкм2варьировалась отдля модели (3.1.3) (B). Пунктир:для обеих моделей, поверхностная кон-11510до1441002 мкм−2для 3.1.1 (A)для 3.1.3 (B). Сплошные линии: поверхностная концентрация сайтовравнаварьировалась отравна4.34 мкм3�sol0.0211510 мкм−2до2.5 мкм2для обеих моделей, площадь поверхности агрегатовдля модели 3.1.1 (A) и до2.46 мкм2�lpsдля модели 3.1.3 (B).Горизонтальными линиями отмечены уровни концентрации калликреина на момент окончания эксперимента и соответствующие концентрации ЛПС, рассмотренные на рис.
3.18 (A) ирис. 3.19 (B).3.2.2Кинетика активации факторовВ обеих экспериментальных установках [17, 18] активность калликреина контролироваласьпо истечении фиксированного времени после добавления ЛПС к модельной системе. Авторыпредположили, что к этому времени было достигнуто некоторое стационарное состояние. Однако истинное стационарное состояние в рассматриваемых системах может быть достигнуто107только тогда, когда весь прекалликреин, присутствующий в растворе, будет расщеплен. Таким образом, представляет интерес кинетика активации факторов.
Мы сравнили кинетикуактивации контактного пути для концентраций ЛПС ниже и выше оптимальной концентрации ЛПС, обеспечивающей максимальную активность калликреина, наблюдаемую в [17, 18].3.2.2.1Активация контактной системы в отсутствие HMWK.Во-первых, рас-смотрим кинетику активации контактной системы для оптимальной концентрации ЛПС,то есть для концентрации ЛПС, обеспечивающей максимальную активность калликреина кконцу эксперимента. В эксперименте, описанном в [17], FXII и ЛПС инкубировали в отсутствие калликреина в течение первых двадцати минут.
По истечении этого периода к системедобавляли калликреин и конечную систему инкубировали еще20 мин. Согласно нашей моде-ли, добавление калликреина к системе значительно ускоряет дальнейшую активацию FXII(рис. 3.18 A, серая линия). Однако, концентрация FXIIa достигает стационарного значениятолько на временах больше40 минс начала моделирования (примерно на 45-ой минуте).Момент измерения в [17], обозначен вертикальными линиями на рис.
3.18.По результатам моделирования концентрация калликреина в растворе далека от стационарного значения к концу эксперимента (рис. 3.18 B, серая линия). Более того, к концу 40-ойминуты эксперимента скорость активации калликреина достигает стационарного значенияоколо0.0016 мкМ/мин (рис.
3.18 B, серая линия), и дальнейшее производство калликреина всистеме происходит до момента активации всего прекалликреина в растворе.Проанализируем поведение системы при различных значениях концентрации ЛПС. Вместе с оптимальным значением концентрации ЛПС (рис. 3.18, серые линии) рассмотрим двеконцентрации ЛПС, для которых к концу эксперимента количество наработанного калликреина составляло0.005 мкM(рис. 3.17 A, горизонтальная линия). Ясно, что равновеснаяповерхностная концентрация FXIIa тем выше, чем больше значение имеющегося объема раствора. В то время как кинетика активации калликреина очень близка в трех рассмотренныхслучаях (рис. 3.18 B), степень активации FXII на поверхности агрегата ЛПС достигает максимальных значений для концентрации ЛПС ниже оптимальной (рис. 3.18 A, пунктирнаялиния), и имеет меньшие значения при высокой концентрации ЛПС (рис. 3.18 A, сплошнаячерная линия).3.2.2.2АктивацияконтактнойсистемывприсутствиеHMWK.ДобавлениеHMWK в раствор существенно влияет на процесс активации контактной системы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
