Диссертация (1103763), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Всего параметров в модели 17. Значениячасти параметров были взяты из литературы, как это было сделано раньше для тех жепараметров в работах [52,82]: ширина потенциала взаимодействия, изгибная жесткостьпротофиламента. Те же параметры, которые не были известны или оценены ранее, былиподобраны так, чтобы описать экспериментальную зависимость скорости ростамикротрубочки от концентрации тубулина, и скорость деполимеризации микротрубочки.После данной калибровки параметры были зафиксированы и была произведенаверификация модели.Параметры были выбраны следующим образом (см.
также Таблицу 1):Параметры r0 и d определяют характерную длину взаимодействия междутубулинами. Ширина потенциальной ямы r0 была выбрана так же, как и впредыдущей работе [52].Параметр Alat определяет разницу значений энергии между минимумом имаксимумом в потенциальной энергии взаимодействия. Параметр blat определяетвысоту барьера. При разборке микротрубочки сначала рвутся поперечные связи, апотом продольные [23,33,119], поэтому скорость деполимеризации микротрубочкиопределяется преимущественно скоростью разрыва поперечных связей. Поэтомупараметры Alat и blat были подобраны так, чтобы скорость деполимеризациимикротрубочки составила 24.4 ± 2.4 мкм/мин (среднее арифметическое ±стандартное отклонение, N=16), что соответствует экспериментальному значению25 мкм/мин [103]. Важно отметить, что параметры Alat и blat были подобраны изафиксированы до выбора параметров Along и blong.Параметры Along и blong были подобраны так, чтобы описать экспериментальнуюзависимость скорости роста микротрубочки от концентрации [103].
Выбранныеэнергии поперечного и продольного взаимодействия достаточно близко совпали соценками [120].52Жесткость k продольной связи между мономерами внутри димера была выбранатак, чтобы ширина полученного потенциала совпадала с шириной потенциальныхям для продольного и поперечного взаимодействия.Жесткость протофиламента на изгиб B была оценена из энергии гидролиза ГТФ,как это было ранее сделано в [52].Равновесные углы χD и χT были оценены из структурных данных по кривизнамзакручивающихся на конце микротрубочки протофиламентов и исходя из того, чтоГТФ димеры склонны образовывать прямые неизогнутые протофиламенты [23,74].Параметр Kon = 8,3 мкМ-1с-1 константы скорости присоединения тубулина к концумикротрубочки был выбран в соответствии с экспериментальным значением [103].Концентрация тубулина в растворе варьировалась для оценки концентрационныхзависимостей в диапазоне 6-20 мкМ [103,44].Параметр частоты гидролиза Khydrol = 0.5 s-1 был выбран близким к значению изработы [64] для расчетов скорости роста и укорочения микротрубочки.
В расчетах,где наблюдались катастрофы микротрубочек, была взята константа «ускоренного»гидролиза Khydrol = 9.0 s-1 и выполнена соответствующая перенормировка (см. пункт«Обработка результатов вычислений»).53Таблица 1. Параметры модели.ПараметрОписаниеВеличинаСпособ определениялибо источникr0Ширина потенциальной ямытубулин-тубулиновоговзаимодействия0.12 нмМолодцов и соавторы,2005 г. [52]DПараметр, описывающийспадающую часть потенциалатубулин-тубулиновоговзаимодействия0.25 нмЕфремов и соавторы,2007г.
[82]AlatОпределяет величину барьерапоперечного потенциалаblatОпределяет глубинупотенциальной ямы поперечноговзаимодействия9.1 kTAinterОпределяет величину барьерапродольного потенциала междудимерами17.6 kTbinterОпределяет глубинупотенциалььной ямы продольноговзаимодействия между димерами15.5 kTKЖесткость внутридимерной связи517 kT/нм2BЖесткость протофиламента наизгиб300 kT/рад2Молодцов исоавторы, 2005 г. [52]χDРавновесный угол между ГДФдимерами в протофиламенте0.2 радМюллер-Райхарт исоавторы, 1998г. [23]χTРавновесный угол между ГТФдимерами в протофиламенте0.0 радМюллер-Райхарт исоавторы, 1998г. [23]ctubКонцентрация тубулина в растворе10-20мкМВеличинаварьироваласьKonКонстанта присоединениятубулина из раствора8.3мкМ-1с-1Волкер и соавторы,1988г.
[103]0.5 с-1Мелки 1996г.,ВанБюрен и соавторы,2002г. [64,87]KhydrolКонстантагидролизаГТФреалистичная16.9 kBTна мономерРезультат калибровкипо скоростям ростапри разныхконцентрацияхтубулина и скоростидеполимеризации54ускоренная9 с-1TТемпература300 KТемпература, прикоторой былипроведеныэкспериментыΗДинамическая вязкость среды0.2 Пa*сВязкость цитоплазмыDtШаг по времени для динамическойчасти вычислений2*10-10 сМаксимальный шаг,при котором алгоритмне расходитсяtkinШаг по времени для кинетическойчасти алгоритма1*10-3 сВыбран эмпирически2.42.4.1Обработка результатов вычисленийНахождение скоростей роста и разборки микротрубочкиСкорость роста и разборки микротрубочки определялись из зависимости положения концамикротрубочки от времени. Положение конца микротрубочки определялось как среднееположение вдоль оси микротрубочки наиболее удаленных от начала роста димеров вкаждом протофиламенте.
Полученная зависимость аппроксиммировалась линейнойрегрессией, и затем из наклона прямой находилась скорость роста либо разборкимикротрубочки.2.4.2Нахождение времени катастрофыДля определения времени жизни микротрубочки необходимо знать в какой моментвремени она испытала катастрофу. Для этого строилась зависимость положения концамикротрубочки от времени. Затем эта зависимость сглаживалась скользящим средним сокном 20 точек.
Полученная сглаженная кривая дифференцировалась по времени. Изизменения производной находился момент катастрофы. Тот момент, в которыйпроизводная координаты конца микротрубочки меняла знак с положительного наотрицательный, падая затем до значения >200нм/с (>12 мкм/мин) принимался за моменткатастрофы (Рис. 18).55А.Б.Рис. 18.
Определение момента катастрофы. А. Зависимость длины микротрубочки от времени.Б. Первая производная длины по времени из А. Серым показана несглаженная производная,зеленым – сглаженная кривая. Ось времени для обоих графиков совпадает. Момент наступлениякатастрофы отмечен вертикальной пунктирной линией.2.4.3Переход от ускоренной к реалистичной константе гидролизаВ данной модели время жизни микротрубочки (время с момента начала фазы ростамикротрубочкидомомента наступления катастрофы) обратно пропорциональноконстанте гидролиза Khydrol на исследованном диапазоне 3-10 с-1 (см. параграф 3.2.1, Рис.27А). Эта зависимость указывает на возможность оценки времени жизни микротрубочкипри физиологической константе гидролиза ~0.5 c-1, зная время жизни при завышеннойконстанте гидролиза и соответствующий коэффициент пересчета. Такой подход оказалсянеобходимым, поскольку катастрофы при физиологической константе гидролизапроисходят на временах, недостижимых для молекулярно-динамических вычислений.
Дляопределения коэффициента пересчета была произведена аппроксимация гиперболическойзависимостью времени жизни микротрубочки при различных частотах гидролиза. Далееполученная зависимость была экстраполирована в область экспериментально полученных56времен жизни микротрубочки: 200-250с [44], что соответствует безразмерномукоэффициенту нормировки 0,012 для Khydrol = 9.0 c-1.
Все времена жизни микротрубочки,полученные при Khydrol = 9,0 с-1, были нормированы делением на безразмерныйкоэффициент 0,012. Когда описанная нормировка была применена для времен жизнимикротрубочки, полученных при разных константах гидролиза с умножением насоответствующие им коэффициенты, нормированные распределения совпали (Рис. 19).А.Б.В.Рис. 19. Нормировка времен жизни микротрубочки при переходе от ускоренной к реалистичнойконстанте гидролиза. А. Распределение времен жизни, полученное в расчете с ускореннойконстантой. Б.
Результат нормировки времен жизни микротрубочки, показанных на панели А. В.Распределения нормированных времен жизни микротрубочки, полученных при различныхконстантах гидролиза.2.5Численная характеристика конфигурации конца микротрубочкиРазличные электронно-микроскопические техники были ранее применены другиминаучными группами для изучения структуры растущего конца микротрубочки. Критерий,используемый для характеристики конца микротрубочки – заостренность конца в каждыймомент времени какразница в длине между самым коротким и самым длиннымпротофиламентом в микротрубочке.С помощью криоэлектронной микроскопии в работе Кретьена и соавторов 1995 года [49]было проанализировано 2910 микротрубочек при трех концентрациях тубулина.
Для того,чтобы сравнить результаты из этой работы с предсказаниями модели, были оцифрованысоответствующие данные с использованием программы GetData Graph Digitizer (Рис. 20,57графики). Полученные значения были использованы для построения интегральногораспределения. Тест Колмогорова-Смирнова был использован для попарного сравненияраспределений соответствующих различным концентрациям (Рис.20, таблицы).Формула, использованная для расчетов:D=max|CDF1(x) - CDF2(x)|,(29)Где N1 и N2 – размеры выборки для распределений, CDF1(x) и CDF2(x) – сравниваемыеинтегральные распределения из [49].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
