Диссертация (1103763), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Что интересно, ЕВ1 ярко окрашивает концы растущихмикротрубочек,ноначинаетисчезатьзанесколькосекундпередпереходоммикротрубочки к катастрофе, после которой, как считается, ГТФ-колпачок уже потерян[57,68], (Рис. 10Б).25А.Б.Рис. 10. Микротрубочко-связывающий фрагмент ЕВ1 Mal3-GFP связывается с растущимиконцами микротрубочек и исчезает перед катастрофой. А. Мечение микротрубочкифлуоресцентным Mal3-GFP (показан зеленым). Б. Локализация Mal3-GFP во время роста иперехода к разборке микротрубочек. Изображены последовательные фотографии микротрубочки вразличные моменты времени. Mal3-GFP показан зеленым, тубулин красным.

Стрелкой отмеченоначало катастрофы. Изображения получены с помощью микроскопии полного внутреннегоотражения (TIRF) [68].Есть и другие работы, косвенно предполагающие большее чем один слой количествоГТФ-тубулинов на конце микротрубочек, растущих in vitro. Хотя, как было сказано выше,ГТФ-колпачокводин-дваслояможетудержатьмикротрубочкуотразборки,высокоточные измерения с использованием оптической ловушки показали изменениедлины в ходе роста микротрубочки более чем на 40 нм, что соответствует 5 и более слоямГТФ-димеров [69,70].Этот результат предполагает, что микротрубочка может иметьразмер стабилизирующего колпачка более 5 слоев.Рассмотренные ранее оценки размера ГТФ-колпачка были сделаны в основном in vitro.Оценки размера ГТФ-колпачка в лаборатории с помощью мечения конца растущеймикротрубочки in vivo флуоресцентным белком EB1, дал значение 750 ГТФ-димеров (~6026слоев) на конце микротрубочки [71], что поддерживает идею о ГТФ-колпачке в клеткахзначительно больше одного слоя.

Следует заметить, что так как скорость ростамикротрубочки in vivo на порядок больше скорости роста in vitro, то размер ГТФ-колпачкаin vivo предположительно отличается в большую сторону от размера in vitro.Итак, на сегодняшний день имеется большое количество работ, направленных на изучениеГТФ-колпачка, но однозначного ответа относительно его размера до сих пор нет.1.2.5Структурные данныеC помощью электронной микроскопии были получены данные о формах концовмикротрубочеквфазахростаиукорочения.Внутристенкимикротрубочкипротофиламенты прямые, в то время как во время деполимеризации протофиламентыимеют закрученную форму.С помощью данного подхода, исследуя микротрубочки на стадиях роста и разборки[33,49,72–74] было показано, что деполимеризация сопровождается закручиваниемпротофиламентов на конце микротрубочки (Рис. 11А), в то время как концы растущихмикротрубочек имеют преимущественно тупые концы [74].А.Б.В.Г.100 нмРис.

11. Криоэлектронные микрофотографии деполимеризующихся (А) и полимеризующихсямикротрубочек (Б). В. Модель полимеризации микротрубочки в виде растущего листа. Согласноданной гипотезе катастрофа происходит в результате перехода листообразной структуры на концев трубочку [49]. Г. Электронные микрофотографии растущих микротрубочек [74].27Подход, основанный на криоэлектронной микроскопии, дал новую гипотезу о механизмекатастрофы. В работе [49] проанализировали микротрубочки, растущие из центросом, иобнаружил на некоторых из них длинные немного загнутые листы протофиламентов нарастущих концах(Рис. 11Б). Из этого возникла гипотеза, что рост микротрубочекпроисходит за счет удлинения этих листообразных структур на конце, а цилиндрмикротрубочкиобразуетсяприпостепенномсворачиваниилиставтрубочку,предположительно вдоль шва (Рис.

11В). Дальнейшее развитие этой гипотезыпредполагало, что сворачивание происходит с изменяющейся скоростью и когда волнаобразования цилиндра из листа достигает самого конца микротрубочки, происходиткатастрофа [49,75]. Однако данная гипотеза не нашла подтверждения в моделировании,которое указывало, что эти длинные структуры на конце микротрубочки всего лишьвыросты отдельных протофиламентов на конце цилиндрической микротрубочки [76]. Вэксперименте сами листообразные структуры не были обнаружены в других работах(Рис. 11Г) [74] и согласно другой точке зрения являются артефактом, связанным смеханическим повреждением трубок.1.31.3.1Математическое моделирование микротрубочкиОбщие принципы моделирования микротрубочкиЗа последние три десятилетия было создано большое количество моделей микротрубочки[77–84,52,85–92,76,48,93,42].

В недавнем обзоре было показано, что включающие всеголишь один протофиламент модели не могут полноценно описать динамическуюнестабильность микротрубочки[48]. Поэтому далее речь пойдет о более подробныхмоделях, в которых структурной субъединицей является мономер либо димер тубулина, атакжевключающихвзаимодействиямеждупротофиламентами.Вмногопротофиламентных моделях происходят следующие события: присоединение новыхмолекул тубулина, разрыв и образование связей, гидролиз ГТФ. Правила, по которым этипроцессы реализуются, так же как и геометрия микротрубочки, и лежащие в основечисленные алгоритмы, отличаются от модели к модели и потому требуют отдельного28рассмотрения.Присоединение новых молекул тубулина на конце микротрубочки происходит по одномуиз двух типов: 1) димер может присоединиться только там, где он образует и поперечную,и продольную связь, как это было описано в самых ранних работах [77–81] 2) дляприсоединения необходимым и достаточным считается образование только продольнойсвязи, и поэтому димеры могут присоединяться продольно ко всем протофиламентаммикротрубочки.

Последнее правило реализуется во всех моделях, начиная с VanBuren etal., 2002 [87]. Отсоединение субъединиц может 1) не учитывать последовательный разрывпоперечной и продольной связи [77–81], либо 2) в явном виде рассматривать сначаларазрыв поперечной связи, а уже потом продольной [88,82,76,42].Изменение нуклеотидного состояния димеров микротрубочки происходит в соответствиис постулируемым правилом гидролиза. Было предложено несколько вариантов правилгидролиза: 1) полностью случайный гидролиз [77,94], когда каждый ГТФ-димер в стенкемикротрубочки может гидролизовать молекулу ГТФ с одинаковой вероятностью, 2)индуцированный [79], когда гидролиз ГТФ в данном димере происходит сразу же послеприсоединения к нему нового димера вдоль того же протофиламента,3) полностьюслучайный за исключением терминального слоя, где гидролиз запрещен [95].

4)векториальный гидролиз [91,96,97], который происходит только на границе ГТФ/ГДФдимеров вдоль оси микротрубочки. В отличие от других правил гидролиза, привекториальном гидролизе переход ГТФ-димеров в ГДФ состояние происходит в видебегущей с постоянной скоростью волны со стороны участка начала роста по направлениюкрастущемуконцумикротрубочки.многопротофиламентныхпродемонстрировано,чтомоделяхэтонеправилоВекториальныйрассматривался.являетсягидролизКромевдимерныхтого,нежизнеспособным,былопосколькукатастрофы микротрубочек в моделях с векториальным гидролизом могут наблюдатьсятолько в нереалистично узком диапазоне концентраций тубулина [48].По алгоритму расчетов можно выделить три класса моделей с детализацией на уровнеотдельных молекул тубулина: кинетические, кинетико-механические и механические.Кинетические модели описывают эволюцию микротрубочки как последовательность29дискретных переходов присоединения и отсоединения димеров, а так же гидролиза.Модели, основанные на этом принципе, используют вероятностный алгоритм МонтеКарло [77–81,87,76], когда каждому элементарному событию соответствует некаяфиксированная вероятность.

Механические же модели используют информацию оположении субъединиц микротрубочки во времени и энергетические характеристикивзаимодействиямолекулвычислительныхресурсов,[84,52,88,82].нотакиеЭтотподходтребуетмоделимогутописыватьгораздобольшегеометрическиеконфигурации микротрубочки, которые, как известно, отличаются в различных фазахдинамической нестабильности микротрубочки [74,98]. Кинетико-механические моделиявляются комбинацией кинетических и механических моделей.Геометрически модели, учитывающие механику, различаются по количеству степенейсвободы, от которого зависит разнообразие конфигураций.

В моделях [84,52,82] дляускорения расчетов каждый протофиламент мог двигаться только в своей плоскости (Рис.15Б), в то время как в модели [88,42] такого упрощения не было. Степень детализациитакже разнится: в части моделей элементарной субъединицей является мономер [88,82,42],в то время как в других – димер [36,52].1.3.2Молекулярно-кинетические моделиТрадиционно наиболее детальный метод описания эволюции системы химическивзаимодействующих частиц – это метод молекулярно-динамических расчетов, так как он вявном виде учитывает тепловые флуктуации, а химические реакции при этомрассматриваются как отдельные физические взаимодействия.

Поскольку реакциипроисходят в результате случайных соударений диффундирующих молекул, эволюциясистемы взаимодействующих частиц является не детерминированной, а стохастической.Часто стохастичностью на уровне соударений отдельных молекул пренебрегают, какнапример в химической кинетике, и рассматривают детерминированное изменениеконцентраций или количества молекул реагентов. Основным уравнением, описывающимхимические превращения, является в таком случае закон действующих масс, система30дифференциальных уравнений следующего вида:dX i f i ( X 1 ,..., X N ) (i  1,..., N )dt(1)где X i – количество молекул вещества под номером i из набора реагирующих веществSi , (i  1,..., N ) , f i – функции, зависящие от специфики реагирующих веществ.Но если количество реагирующих молекул хотя бы одного из компонентов достаточномало, то стохастичность может вносить очень значительный вклад в процесс.

В случаемикротрубочки присоединения новых димеров происходят на торце, и поэтомуколичество взаимодействующих в микротрубочке димеров с теми, что диффундируют врастворе, всего 13. А значит, пренебречь стохастикой и рассмотрением отдельныхвзаимодействий не представляется возможным [99]. Далее будут приведены методы, спомощью которых моделируется динамика микротрубочки на уровне отдельныхвзаимодействий.Одним из наиболее часто применяемых алгоритмов в моделировании микротрубочкиявляется кинетический метод Монте-Карло. Нас интересует условная вероятностьперехода системы в состояние X (t )  x из начального состояния в момент времени t0X (t0 )  x0 .

В методе Монте-Карло в численном виде находят стохастические траекторииX (t ) вместо аналитического нахождения функции плотности вероятности FX (t ) . Для этогоиспользуют функцию вероятности:p( , j | x , t )d  [вероятность, что в состоянии X (t )  x произойдетреакциявбесконечно малый интервалвремени[t   , t    d ] и эта реакция будетR j ](2)Точная формула для p ( , j | x , t ) [100,101]:p( , j | x, t )  a j ( x) exp(a0 ( x ) )гдеMa0 ( x )   a j ' ( x )(3)(4)j '1Уравнение (3) является математической основой для моделирования с помощью31стохастической химической кинетики.

Характеристики

Список файлов диссертации