Диссертация (1103763), страница 3
Текст из файла (страница 3)
3. Строение микротрубочки. Структурная субъединица микротрубочки –гетеродимер белка тубулина. Красным цветом показаны молекулы ГТФ, связанные скаждым мономером. Рисунок адаптирован из [4]. Справа – иллюстрация решеткимикротрубочки. Темно-серым цветом показаны β-мономеры, светлым – α-мономеры.Шов, на котором происходит взаимодействие β и α мономеров, отмечен стрелкой. Рисунокадаптирован из [11].В свою очередь, связанные боковыми связями протофиламенты составляют самумикротрубочку.
Связи, которыми тубулины взаимодействуют друг с другом вдоль одногопротофиламента, называются продольными. А связи между тубулинами в соседнихпротофиламентахназываютсяпоперечными.Вклеткемикротрубочкиимеютфиксированное число протофиламентов – 13, в то время как в микротрубочках, растущихin vitro, число протофиламентов колеблется от 10 до 18 [6,7]. Микротрубочка имеетполярность: тот конец, который заканчивается β-субъединицами, называется плюсконцом. Противоположный же конец с α-субъединицами на краю называется минусконцом.
При росте микротрубочек в митотическом веретене минус-конец закреплен вцентросоме, а плюс-конец активно растет и укорачивается. Примечательно, что плюс- иминус- концы имеют разные характеристики: плюс-концы быстрее удлиняются, номедленнее укорачиваются, чем минус-концы [8–10].14Полярность микротрубочки также определяет направление движения таких моторныхбелков, как например кинезины [12], которые перемещаются в строго определенномнаправлении вдоль микротрубочки и используют для перемещения энергию гидролизаАТФ.
Другое интересное структурное свойство микротрубочки – спиральность.Протофиламенты связаны друг с другом таким образом, что один виток по окружностимикротрубочки происходит со сдвигом в 3 мономера (Рис. 3Б). Область между этимипротофиламентами называется швом, на котором в решетке микротрубочки происходитпоперечное взаимодействие между α- и β- мономерами [13].Описанный тип решетки микротрубочки называется B-решетка, когда везде кроме швапоперечно взаимодействуют мономеры одного типа: α-α, β-β. В самых ранних работаходнако предполагалось, что укладка димеров в стенке микротрубочки происходит попринципу А-решетки, когда поперечные взаимодействия во всей микротрубочке α-β и β-α[14], а также нет шва. Однако с помощью изображений высокого разрешениямикротрубочек, покрытых моторными белками, было установлено, что микротрубочкаимеет тип В-решетки со швом [15–18].Рост микротрубочки происходит благодаря присоединению к ее концу молекул тубулина.Каждый мономер тубулина в присоединенном димере связан с молекулой ГТФ.
Однаковскоре после присоединения молекула ГТФ, связанная с β-мономером, гидролизуется ипреобразуется в ГДФ [19,20], в то время как вторая молекула ГТФ в α-тубулине никогдане испытывает гидролиз [21]. Димеры тубулина в растворе практически не обладаютГТФазной активностью [22]. Продольно связанные ГТФ-димеры (те, в которых обануклеотида – ГТФ) стремятся образовать прямую линейную структуру, в то время какГДФ-димеры (содержащие ГДФ в β-субъединице) имеют радиус кривизны 20 нм [23,24].ЗасчетпостоянногоприсоединенияГТФ-димеровкконцумикротрубочкиипоследующего их гидролиза происходит удлинение микротрубочки с сохранением на ееконце слоя димеров, не успевших еще гидролизовать молекулу ГТФ.
Поскольку ГТФдимеры стремятся принять прямую конформацию на растущем конце микротрубочки,этот опоясывающий трубочку слой не дает выгнуться наружу нижележащим ГДФдимерам и таким образом предохраняет микротрубочку от разборки. Слой ГТФ-димеровна конце растущей микротрубочки принято называть ГТФ-колпачком [25].151.2.2Динамическая нестабильностьПри наблюдении за ростом микротрубочек было сделано важное открытие, что они могутспонтанно переключаться между фазами медленного роста и быстрой деполимеризации.Это свойство получило название «динамическая нестабильность» [26].
Удивительнымявляется тот факт, что такие переключения происходят при постоянной концентрациитубулина и прочих неизменных экспериментальных условиях. Исторически сложиласьследующая терминология: переход от медленного роста к укорочению принято называть«катастрофой», а обратный переход от укорочения к росту – «спасением» (Рис.
4).Динамическая нестабильность энергетически очень затратна для клетки, так какнепрерывно расходует энергию гидролиза ГТФ. Однако крайняя консервативностьданного механизма среди живых существ предполагает его важное биологическоезначение для клетки [25]. Например, во время митоза постоянный рост и укорочениемикротрубочек веретена деления позволяет митотическому веретену эффективноисследовать пространство внутри клетки, находить и связываться с кинетохорамихромосом. Кроме того, во время деления важной задачей является абсолютно правильноеразделение генетичекого материала: сестринские хроматиды каждой хромосомы должныбыть разделены между новыми клетками. А для этого каждая хроматида должна бытьприкреплена перед делением хромосомы к микротрубочкам только из одного полюса,иначе правильного деления не произойдет [27] и возникнувшая «ошибка» приведет кгибели клетки или образованию раковой клетки [2,3,28].
Для образования правильногозакрепления микротрубочек с хромосомами используется динамическая нестабильность, врезультате которой неправильно закрепленные микротрубочки испытывают катастрофу изатем начинают расти заново [27,29]. Другой пример – переключение микротрубочекмежду фазами роста и разборки во время движения клетки позволяет ей проводитьбыструю реорганизацию цитоскелета, в то время как в противном случае сменапространственной организации цитоскелета была бы очень медленной и проблематичной[30].16Рис. 4. Фазы динамической нестабильности микротрубочки.
А. Схема переключения междуростом и укорочением (адаптирован из [4]). Б. График зависимости длины микротрубочки отвремени иллюстрирует последовательно сменяющие друг друга фазы роста и укорочениямикротрубочки. Два набора точек соответствуют относительным приращениям с двух концовмикротрубочки. Наблюдение сделано методом микроскопии темного поля (рисунок адаптированиз Horio and Hotani, 1986 [9]).На сегодняшний день нет четкого представления о том, каков молекулярный механизмкатастроф и спасений микротрубочки. Однако известно, что ключевую роль в механизмединамической нестабильности играет способность тубулина гидролизовать связанную сним молекулу ГТФ и испытывать при этом конформационные изменения [23,24].Действительно, микротрубочки,полимеризованные в присутствии негидролизуемогоаналога ГТФ, непрерывно растут и не испытывают катастроф [31]. Микротрубочка,составленная из ГДФ-димеров, является крайне нестабильной и терпит разборку.
В пользупоследнего утверждения говорят опыты с разрезанием микротрубочки сфокусированнымультрафиолетовым лазером или тонкой иглой [32,33], в которых удалялся ГТФ-колпачоки микротрубочки немедленно разбирались со стороны плюс-конца. Данные экспериментыпривели к модели катастрофы как случайной потере стабилизирующего ГТФ-колпачка.Микротрубочки выполняют в митозе ключевую роль по развитию силы, необходимой для17перемещения хромосом [13,34–38].
Сила может развиваться не только во время разборкимикротрубочки [37,39], но и во время полимеризации [40,41]. Эта способностьмикротрубочек необходима для функционирования веретена деления и всего процессамитоза в целом.1.2.3Феномен «старения» микротрубочекКатастрофы как одно из ключевых свойств микротрубочки интенсивно изучалисьэкспериментально и теоретически в течение последних нескольких лет [9,26,42]. Спомощью анализа времени и длины роста микротрубочки с момента начала фазы роста домомента наступления катастрофы было установлено, что вероятность переходамикротрубочки от роста к разборке увеличивается по мере роста микротрубочки [43]. Тоесть более «молодые» (для которых время с момента начала роста меньше)микротрубочки с меньшей вероятностью склонны испытать катастрофу, чем более«старые». Этот феномен был назван «старением»[44].
Микротрубочки выращивались впроточной камере и регистрировалось изменение их длины в зависимости от времени.Эксперимент был проведенвнутреннего отраженияс использованием флуоресцентной микроскопии полного[45,46] и с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии (контраста Номарского).
Обработка производилась с помощьюпостроения специальных изображений – кимограмм. Для построения кимограммы бралисьизображения одной длины вдоль фиксированной линии, проходящей через наблюдаемуюмикротрубочку в различные моменты времени, захватывая участки поля в стороны отконцов микротрубочки. Далее эти линии располагались одна под другой и формировалидвумерную картину зависимости длины микротрубочки от времени.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
