Диссертация (1103763), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Смомента начала полимеризации тубулина размер ГТФ-колпачка в модели быстро начиналрасти и достигал стационарного состояния через 4-7 секунд, достигая количества 8-10ГТФ-слоев, что соответствует ~120 ГТФ-димерам на микротрубочку при концентрации 10мкМ тубулина (Рис. 23А и Рис. 36А). Полученные в модели предсказания лежат внутридиапазона как экспериментальных, так и теоретических оценок [54,87,71,76,68].Стационарный размер ГТФ-колпачка увеличивается пропорционально концентрации, ахарактерное время достижения стационарного состояния меняется мало (1.9 ± 0.1 с для 10мкМ, Рис. 36Б).А.75Б.Рис. 36. А. Полное количество ГТФ-димеров в микротрубочке как функция времени дляконцентраций тубулина 10 и 20 мкМ (аппроксимация экспоненциальными функциями). Б.Стационарное значение ГТФ-колпачка микротрубочки и характерное время достижениястационарного значения(при начале расчетов с тупым концом) для различных концентрацийтубулина.
Данные представлены средним значением и нанесена ошибка среднего. Каждой точкесоответствует N = 32 расчетов, линии – результат линейной аппроксимацииЧтобы протестировать стабилизирующие свойства ГТФ-колпачка, были проведенырасчеты, описывающие опыты с удалением тубулина из камеры с полимеризующимисямикротрубочками [59], когда микротрубочки сначала выращивались при некоторойфиксированной концентрации тубулина, а потом тубулин резко убирался из камеры путемзамещения буферного раствора и отсчитывалось время до наступления катастрофы (см.Обзор литературы). В расчетах концентрация тубулина скачком снижалась до 0 мкМпосле 6.5 секунд полимеризации.Вслед за убиранием тубулина микротрубочки переставали расти и переходили в состояниемедленного укорочения (Рис.37, зеленые кривые), в процессе которого отдельныедимеры тубулина и выросты протофиламентов диссоциировали с конца микротрубочкибез формирования характерного для стадии деполимеризации раскрытого венчика (Рис.38, 0-3.2 с).76А.Б.Рис.
37. Примеры зависимостей длины микротрубочки (зеленые кривые) и количества ГТФтубулинов (черные кривые) от времени в расчетах с быстрым удалением тубулина. Ростмикротрубочек происходил в течение ~6 секунд при константе гидролиза Khydrol = 0.5 с-1 иконцентрации тубулина 10 мкМ (А.) и 20 мкМ (Б.), после чего концентрация тубулина принималанулевое значение (момент падения концентрации тубулина до 0 мкМ отмечен черной стрелкой).Таким образом, разборка происходила не за счет быстрого разрыва поперечных связей ипоследующегоотрывапродольных,когдадиссоциируютцелыеолигомеры,апреимущественно посредством отрыва одиночных димеров.
После удаления тубулинаразмер ГТФ-колпачка спадал экспоненциально, как и ожидается в случае случайногогидролиза. Удивительно, но катастрофа происходила только через 1,7±0,5 секунд послеполной потери ГТФ-колпачка. Наступление катастрофы сопровождалось образованиемформы раскрытого венчика (Рис.38, 3.3с). Этот результат указывает на то, чтомикротрубочка может существовать некоторое время без ГТФ-колпачка в метастабильномсостоянии.
Предыдущие работы предполагали наличие такого состояния как результатотсутствия искривленных протофиламентов на конце микротрубочки [33].77Рис. 38. Конфигурации микротрубочек в различные моменты времени после удалениятубулина(0 секунд). Начальная концентрация тубулина была 10 мкМ, Khydrol = 0.5 с-1.Вследствие наличия стабильного состояниябез ГТФ-колпачка, микротрубочкииспытывали катастрофу с задержкой, как и в эксперименте. А время задержкисоответствовало наблюдаемому в эксперименте (Рис. 39). Отдельно следует подчеркнуть,что данный результат не требовал дополнительной настройки параметров.78Рис. 39. Время между удалением растворимого тубулина и началом катастрофы в зависимости отначальной концентрации тубулина. Каждая точка соответствует индивидуальному расчету. Линия– результат линейной регрессии экспериментальных данных (p = 0.052).
Красные точки –теоретические значения времен от начала удаления тубулина до начала катастрофы с добавлениемвремени 3 секунды, за которое концентрация тубулина в эксперименте падала до 86%. Такаядобавка была сделана для того, чтобы сопоставить экспериментальные данные с медленнымудалением тубулина и теоретические с мгновенным падением концентрации до нуля.Экспериментальные данные взяты из статьи Волкер и соавторы 1991 года [59].Далее,чтобы рассмотреть подробнее стабилизирующие свойства отгибающихсяпротофиламентов, были сделаны расчеты с двумя разными начальными конфигурациями,когда трубочка без ГТФ-димеров не имела изогнутых протофиламентов на конце, и когдавсе 13 протофиламентов были отогнуты на конце микротрубочки, как обычно бывает удеполимеризующихся микротрубочек.
Те микротрубочки, у которых отогнуты были все13 протофиламентов, тут же начали разборку (N = 32), в то время как в случаемикротрубочек с тупым концом катастрофа наступила только через ~2 секунды, чтопоказывает явный эффект изогнутых протофиламентов на снижение стабильностимикротрубочки (Таблица 2, Рис. 40).3.4.2Влияние искривленных олигомеров на переход к катастрофеОписанные выше результаты подразумевают, что на вероятность наступления катастрофы79влияет не только размер ГТФ-колпачка, но и конфигурация конца микротрубочки. Чтобыпроверить, являются ли искривленные на конце микротрубочки протофиламентыфактором, приводящим к катастрофам, была оценена вероятность наступлениякатастрофы у микротрубочек с различным сочетанием и количеством искривленныхпротофиламентов на конце в присутствии 10 мкМ растворимого тубулина.А.Б.В.Г.Д.Рис.
40. Схематическая иллюстрация различных конфигураций конца микротрубочки,использованных для анализа стабильности микротрубочек. Слева направо: А. тупой конец, Б.микротрубочка с загнутыми протофиламентами, расположенными через один на тупом конце, В.микротрубочка с загнутыми протофиламентами, расположенными подряд, Г. загнутые ГДФпротофиламенты чередуются через один с выпрямленными, Д. На конце каждого из отогнутыхГДФ-протофиламентов расположены по 4 ГТФ-димера.В соответствии с описанным относительно стабильным состоянием микротрубочки ступым концом без тубулина в растворе, данная конфигурация привела к устойчивомуросту в 100% случаев (Рис.
40А, Таблица 2). Добавление одного искривленногопротофиламента на конец микротрубочки с тупым концом не изменило исход, так кактакой олигомер быстро диссоциировал и реализовывалось состояние с тупым концом ипоследующим стабильным ростом. Даже добавление 6 таких изогнутых олигомеров наконец каждого второго протофиламента таким образом, чтобы между протофиламентовбыли пропуски (6 единичных пропусков и один двойной, так как в микротрубочке 13протофиламентов), приводило к устойчивой полимеризации: только лишь 1 из 3280микротрубочек в таком расчете испытала катастрофу в течение первых 0,5 секунднаблюдения.Однако то же самое число изогнутых протофиламентов, расположенных не через один, адруг за другом без пропусков, либо же когда 6 протофилметов разделялись не пробелами,а прямыми ГДФ-димерами, приводило к гораздо более частым катастрофам.
В последнемслучае прямые ГДФ-протофиламенты без поперечных связей быстро изгибались. Врезультате для обоих этих случаев катастрофы наступали в 23-26 случаях из 32 в течениепервых 0,5 секунд наблюдения (Таблица 2).Таблица 2. Стабильность микротрубочки при различных конфигурациях конца. Концентрациятубулина 10 мкМ, константа гидролиза Khydrol 9 с-1, длительность каждого расчета 0.5 с.#Конфигурация микротрубочки1Тупой конец2ОтгибающиесяГДФпротофиламенты, расположенныечерез один на тупом концемикротрубочкиКоличествоотогнутыхолигомеровна конце0 (Рис. 40 А.)3отогнутыконца020416 (Рис.
40 Б)ГДФ-протофиламентыподрядступогомикротрубочкиКоличествомикротрубочек,испытавшихкатастрофу (из N=32повторов)12294296 (Рис. 40В)218211026814a4b5Отгибающиесяпротофиламенты,через один свыпрямленнымипротофиламентамиОтгибающиесяпротофиламенты,черезодинсвыпрямленнымипротофиламентами1226226423ГДФчередующиесяодинарнымиГДФ-6 (Рис. 40 Г)ГДФчередующиесядвойнымиГДФ-ГТФ-димеры на конце отогнутыхГДФ-димеровнаверхуГДФмикротрубочки.
На конце каждогопротофиламента 4 ГТФ-субъединицыповерх отогнутого ГДФ-димера.2522042113 (Рис. 40Д)24Данный анализ конфигураций показывает, что искривленные олигомеры на концемикротрубочки имеют дестабилизирующий эффект. Подобное дестабилизирующеесвойство объясняется неспособностью вновь присоединенных ГТФ-димеров на концетаких олигомеров стабилизировать микротрубочку (см. для примера Рис. 13).3.4.3Связь между процессом «старения» и накоплением искривленныхпротофиламентовИскривленные протофиламенты на конце растущей микротрубочки встречаются вописываемоймодели.Ихколичествосильнофлуктуирует,иногдадостигаямаксимального значения 13 (Рис. 41). Большое количество изогнутых протофиламентовне обязательно тут же приводит к катастрофе (Таблица 2 пункт 3), так как подобные«дефекты» могут быть быстро «исправлены» путем диссоциации олигомеров тубулина ивстраивания на их место стабилизирующих ГТФ-димеров.82Рис.
41. Кинетика формирования искривленных протофиламентов перед наступлениемкатастрофы. Каждая из отдельных тонких кривых показывает индивидуальный расчет для одноймикротрубочки, со временем в нуле соответствующим началу катастрофы. Толстая оранжеваялиния показывает усредненную по всем расчетам зависимость приращения длины микротрубочкиот времени, N = 52.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
