Диссертация (1103763), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Б. Интегральные распределения длин микротрубочки перед катастрофойпри различных концентрациях тубулина. Черные кривые в обоих случаях (сплошные ипунктирные) – экспериментальные значения из [123].3.3Существующие в литературе гипотезы, направленные на объяснение«старения»3.3.1Модель накопления необратимых дефектовОдна из существующих моделей, пытающаяся объяснить процесс старения, постулируетнеобратимое накопление изменений в стенке микротрубочки, приводящее к постепеннойдестабилизации с каждым новым таким изменением или «дефектом». При этом дефектысогласно этому предположению необратимы: однажды возникнув, они уже не исчезают досамой катастрофы (Рис.
8А, [48]). Чтобы ответить на вопрос, возникают ли подобныедефекты в стенке микротрубочки в модели, были визуально исследованы конфигурациимикротрубочек и никаких видимых отклонений либо накапливающихся измененийобнаруженонебыло.Теполимеры,которыеиспытываликатастрофы,имеликонфигурации стенки микротрубочек визуально не отличающиеся от стабильно растущихмикротрубочек, не было обнаружено ни пропущенных в стенке димеров, ни каких-либодругих отклонений. В дополнение к визуальному анализу мы сделали серию расчетов, вкоторых динамика рассчитывалась только для фиксированного количества слоев димеровна самом конце растущего полимера. Эти слои начинали отсчитываться в направленииудаления от конца микротрубочки, начиная от ближайшего к концу слоя, не содержащегоразорванных поперечных связей.
Те же димеры, которые были ниже этих слоев, были68«неактивны» и не получали ни тепловых приращений, ни изменений в координатахвследствие взаимодействия с другими димерами в микротрубочке.По мере ростамикротрубочки окно «активных» димеров смещалось вслед за концом удлиняющегосяполимера (Рис. 30А).Б.А.Рис. 30. А. Схематическое изображение схемы расчета, при котором различное количество слоевдимеров микротрубочки было исключено из динамики (полупрозрачная часть микротрубочки).Количество слоев отмерялось от ближайшего к концу слоя, не содержащего разорванныхпоперечных связей, при этом все димеры над этим слоем были подвижны. Б.
Параметрыдинамической нестабильности при различных значениях количества слоев подвижных димеров.Каждая колонка отображает среднее значение ± ошибка среднего, полученные на основании 9-14полимеризующихся микротрубочек, 7-16 деполимеризующихся и 53-70 микротрубочек,испытавших катастрофу.Было проварьировано количество слоев «активных» димеров: 4, 7 и 10. В результатескорости роста, разборки, а также частоты катастроф не изменились ни в одном из этихслучаев (Рис.30Б). Это показывает, что процесс «старения» в модели не связан снакоплением необратимых дефектов в стенке микротрубочки. В противном случаевозникающие изменения должны были бы сохраняться в стенке микротрубочки иудаляться от конца по мере его удлинения, выходя из зоны активных димеров, а значитпереставая вызывать катастрофы.Для дальнейшего анализа механизма катастрофы и проверки необратимости вызывающихее изменений, были найдены точные времена наступления катастрофы для отдельныхмикротрубочек.
Затем для такой траектории был выбран шаг отступления назад повремени от момента катастрофы и найдена соответствующая конфигурация. Для69начальной «предкатастрофической» конфигурации был продолжен расчет и найденовремя, через которое такая микротрубочка испытает катастрофу вновь. Удивительнымрезультатом явился тот факт, что даже микротрубочки, для которых расчет былпродолжен прямо с момента катастрофы, испытали немедленную повторную катастрофутолько в 90% случаев, в то время как остальные 10% продолжили расти (Рис. 31А).А.Б.Рис. 31. А.
Доля микротрубочек, испытавших катастрофу немедленно после начала расчета сотступлением назад по времени от момента катастрофы. Данные основаны на 70 расчетах длякаждого значения времени отступления назад. Ошибки – стандартные отклонения, полученныеметодом «bootstrapping» [124,125]. Зависимость аппроксимирована экспонентой, показатель τ=4,2с. Б. Распределения времен жизни микротрубочки, полученных для различных отступлений отвремени катастрофы.
Начальными конфигурациями для данных расчетов были те, в которыхмикротрубочки находились за указанное время до наступления катастрофы. Полученныераспределения сравниваются с изначальным распределением на Рис. 28А. Аппроксимация Гаммафункцией (в частном случае дающей экспоненту). Времена жизни микротрубочек былинормированы (см. параграф 2.4.3).Данный результат указывает на то, что катастрофа является обратимым процессом даже всамый близкий к ее началу момент. Однако эти микротрубочки были явно«предрасположены» к катастрофе, так как распределение их времен жизни с моментаначала повторного расчета имело вид экспоненты, а не распределения с пиком (Рис.
31Б,красная линия). То есть для них катастрофа наступила как одностадийный процесс.По мере того, как начальные конфигурации для повторных запусков выбирались все70дальшеотмоментакатастрофы,фракциянемедленноиспытавшихкатастрофумикротрубочек уменьшалась. Практически все микротрубочки с отступлением 11 с доначала катастрофы продолжили рост, не испытав немедленной катастрофы после началаповторного расчета (Рис. 31А), указывая на то, что при данном отступлении они былипредрасположены к катастрофам не более, чем выращенные из затравки микротрубочкибез «предыстории». Действительно, микротрубочки с отступлением от моментакатастрофы 11 секунд имели распределение времен жизни с пиком, близкое к тому,которое получается для микротрубочек, имеющих начальную конфигурацию затравки (см.Материалы и методы).Совместно с расчетами с различным количеством «активных» димеров, эти результатыуказывают на отсутствие накопления медленных необратимых дефектов в стенкемикротрубочки.
А так же на то, что молекулярные события, приводящие к катастрофе,проявляются на самом конце микротрубочки, а не в ее стенке.3.3.2Отсутствие медленных изменений конформации конца микротрубочкиДля того, чтобы понять, меняется ли конфигурация конца микротрубочки со временем,как это было предсказано с помощью ранее опубликованной модели [42], был проведенследующий анализ: измерялась заостренность конца в каждый момент времени какразница в длине между самым коротким и самым длинным протофиламентом вмикротрубочке. На Рис. 32 видно, что заостренность меняется очень сильно для каждойотдельной микротрубочки. Она начинает расти с момента начала расчета, а затем выходитна стационарный уровень через ~2 секунды.
Заостренность сохраняется относительнонебольшой в течение всей жизни микротрубочки: при 10-20 мкМ тубулина средняявеличина заостренности после достижения стационарного уровня составляет 60-90 нм или8-12 димеров тубулина, что близко к значениям, полученным с помощью криоэлектронной микроскопии [74]. В более ранней работе [126] было показано, что сувеличениемконцентрациитубулинатакжевозрастаетзаостренностьконцамикротрубочки: медианное значение ~20 нм для 45 мкМ и ~80 для 90 мкМ тубулина.71В работе Кумбс и соавторов 2013 года [42] были исследованы микрофотографии 29микротрубочек и был сделан вывод, что среднее значение «изрезанности» (расстояниямежду концом самого длинного протофиламента и самого короткого) линейно возрастаетот ~20 до 90 нм при изменении длины микротрубочки (длина линейно в данном случаесвязана со временем жизни) от ~1 до 4 мкм (Рис.
3B в Coombes et al., 2013). И хотяпредсказанная в модели изрезанность микротрубочки находится внутри диапазона,обнаруженного в данной работе (60-75 нм, Рис.32), в представленной моделиизрезанность возрастает гораздо быстрее с момента начала полимеризации чем в работеКумбс, а также в отличие от этой работы изрезанность быстро достигает стационарногосостояния и не увеличивается линейно на протяжении всего роста микротрубочки.Такимобразом, в отличие от предыдущей работы [42], наша модель не предсказываетпостоянное увеличение заостренности микротрубочки в течение всей ее жизни.Рис.
32. Заостренность конца микротрубочки (разница в длине между самым длинным и короткимпротофиламентом) как функция времени для двух концентраций тубулина: 10 мкМ (чернаякривая) и 20 мкМ (серая кривая). Аппроксимация с помощью экспоненциальной зависимости.Константа гидролиза Khydrol = 0.5 s-1.Далее, чтобы проверить этот результат, были проведены расчеты, в которых былиразличные начальные значения заостренности конца при неизменном количестве ГТФдимеров на конце (Рис.33): заостренный, тупой (как в случае с затравкой безвыступающих протофиламентов), а так же незначительно изрезанный (как в стационарномсостоянии при полимеризации).72Рис. 33.
Изменение заостренности конца микротрубочки при запуске расчетов из начальныхсостояний с различной заостренностью. Слева направо в каждой из четырех временных рамок:заостренный конец, тупой конец, стационарное состояние. Khydrol = 0.5 с-1 и концентрация тубулина10 мкМ. Видно, что через ~3 секунды все три микротрубочки имеют сопоставимую степеньзаостренности.На Рис.33 и Рис.34 видно, что в процессе эволюции микротрубочки, тупой изаостренный конец постепенно пришли к стационарному состоянию заостренности.Таким образом, значение заостренности микротрубочки в модели устойчиво: концыстремятся принять стационарное состояние вне зависимости от начальной конфигурации.73Рис.
34. График изменения заостренности конца микротрубочки при начале расчета из состоянийс различной заостренностью: заостренный конец, тупой конец, стационарное состояние. Каждаякривая усреднена по N=32 расчетам.Также было проведено сравнение заостренности и кинетики ее изменения во времени вмодели в ранее опубликованных экспериментах с использованием электронномикроскопических изображений и флуоресцентной микроскопии. Предсказания моделинаходятся в соответствии с результатами нескольких других работ, согласно которымстационарная заостренность возрастает с увеличением концентрации тубулина (Рис.
35А)[49,44,42].Однако экспериментальные данные в данном вопросе расходятся относительно кинетикиизменения заостренности со временем. Предсказания данной модели о том, чтозаостренность возрастает в начальный момент времени в течение нескольких секунд, апотом остается постоянной, находится в несоответствии с другой работой [42], но находитподтверждение в нашем собственном анализе данных [49]. Рассмотрение статистическойдостоверности данных о заострении конца микротрубочки показало отсутствие значимыхизменений в заостренности в эксперименте в моменты времени 1, 3 и 5 минут от началароста (Рис.
35Б, Рис.20 и 2.5 Численная характеристика конфигурации концамикротрубочки). То есть в данной модели процесс «старения» не может быть обусловленпостепенным нарастанием заостренности микротрубочки.74А.Б.Рис. 35. А. Стационарное значение заостренности конца микротрубочки и характерное времядостижения стационарного значения (при начале расчетов с тупым концом) для различныхконцентраций тубулина. Данные представлены средним значением и нанесена ошибка среднего.Каждой точке соответствует N = 32 расчетов, линии – результат линейной аппроксимации. Б.Значения заостренности конца микротрубочки, полученные в работе Кретьена и соавторов 1995 г.[49] из данных электронной микроскопии для 13 мкМ тубулина.3.43.4.1Влияние конфигурации конца микротрубочки на ее стабильностьМетастабильное состояние микротрубочки в отсутствии ГТФ-колпачкаДля более детального понимания механизма катастрофы и механизма «старения»микротрубочки была исследована роль ГТФ-колпачка в динамической нестабильности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
