Диссертация (1103763), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Данный анализ выявил, что из 12 парных сравненийраспределений 5 пар показали отсутствие статистически значимого сравнения при разныхвременах с момента начала роста микротрубочек (Рис.20, см. так же Рис. 35Б).Остальные 7 пар показали статистически значимое различие, но при этом не образоваливременной последовательности: 3 пары имели уменьшение изрезанности с увеличениемвремени жизни микротрубочки, а 4 наоборот показали увеличение.58Рис.
20. Статистический анализ распределений заостренности конца микротрубочки [49].Приведены гистограммы для различных концентраций тубулина и времени роста микротрубочек.ВеличинаDбылавычисленапоформулеD =max|CDF1(x) - CDF2(x)|,(29)). Параметр α соответствует уровню значимости. Условное обозначение “NS” соответствуетотсутствию достоверных различий между распределениями.592.6Упрощенная модель эволюции микротрубочкиДля более детального анализа статистики катастроф была создана упрощеннаякинетическая модель. Микротрубочка была представлена как объект с наборомвозможных конфигураций (состояний) {Si}.
Изначально система находится в состоянии S0и далее может переходить между состояниями с характерным временем tf для перехода вследующее состояние и tb для перехода в предыдущее состояние (Рис. 21):(30)Для заданного шага по времени dt вероятность прямого переходаPf = 1 – exp(- dt / tf )Вероятностьобратногопереходавычисляетсяаналогичным(31)образом.Длявсехвычислений шаг по времени dt был выбран как минимум в 10 раз меньше, чем самоекороткое время перехода. Алгоритм был реализован в среде Malab 2012.Рис. 21. Схематическое представление упрощенной кинетической модели с N состояниями ивозможностью прямого и обратного перехода между ними.
Переходы отмечены стрелками, tf –характерное время прямого перехода, tb – характерное время обратного перехода. Черные точкиобозначают обратимые события с текущим количеством n ≤ N. Каждый отдельный переход либодобавляет, либо уменьшает количество данных событий на 1. Состояние под номером Nсоответствует катастрофе, обратного перехода из него нет.60ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ3.1Сравнение результатов моделирования с имеющимися экспериментальнымиданнымиСкорость роста и разборки микротрубочки определялись из зависимости положения концамикротрубочки от времени. Расчет динамики микротрубочки начинался из конформации с10 слоями негидролизуемых ГТФ-тубулинов. Рост такой микротрубочки идет соскоростью приблизительно 2 мкм/мин при концентрации тубулина 10 мкМ (Рис. 22А) искоростьвозрастаетлинейносувеличениемконцентрациитубулинатак,какпредсказывает эксперимент (Рис.
22Б).А.Б.Рис. 22. Скорости роста микротрубочки. А. Зависимости длины микротрубочки от времени,полученные в модели при двух концентрациях тубулина с шагом сохранения данных 2 мс.Константа гидролиза Khydrol = 0.5 с-1. Б. Зависимость скорости роста микротрубочки отконцентрации тубулина. Экспериментальные данные для сравнения взяты из работы Волкер исоавторы 1988 года [103]. Каждое теоретически полученное значение на графике является среднимпо 8 и более повторениям, нанесена ошибка среднего.В модели концы микротрубочки во время деполимеризации имеют закручивающиесяпротофиламенты.
Концы растущих микротрубочек прямые (Рис. 23А,Б) [74,49].61А.Б.Рис. 23. А. Примеры конфигураций концов микротрубочки, полученные в модели. Зеленымцветом показаны ГДФ-димеры, красным оттенком – ГТФ-димеры. А. Формы растущих концов приконцентрации тубулина 10 мкМ и константе гидролиза 0,5 с-1 преимущественно прямые сбольшим количеством ГТФ-тубулина.Б.Типичные формы концов укорачивающихсямикротрубочек при концентрации тубулина 0 мкМ.Фотографии разбирающихся in vitro концов, сделанные с помощью электронноймикроскопии [33,74], соттветствовали тем, что наблюдались в результате расчетов.Формы закручивающихся олигомеров определялись параметром χD и их совпадение сэкспериментом было ожидаемо (Рис.24А). Но совпадение с экспериментальнымизначениями длины закручивающихся протофиламентов (Рис.
24 Б) является одним изрезультатов модели. Подобное соответствие не наблюдалось в более ранних молекулярномеханическихмоделях,вкоторыхзакручивающиесяпротофиламентынереалистично короткими [88] или были искусственно зафиксированы [82,121].были62А.Б.Рис. 24. А. Профили протофиламентов на концах укорачивающихся микротрубочек в модели и вэксперименте in vitro. Экспериментальные данные взяты из работы МакИнтош и соавторы 2008,Мандельков и соавторы 1991г. [74,121]Б.Распределения длин закручивающихсяпротофиламентов в модели и в эксперименте.
Средняя длина закручивающегося протофиламентав модели 39 ± 21 нм (среднее ± стандартное отклонение, N = 12861) и в эксперименте 40 ± 15 нм(N=72).Средняя скорость разборки микротрубочки в модели 24.4 ± 2.4 мкм/мин (среднееарифметическое ± стандартное отклонение, N=16). Скорость различна не только дляразных микротрубочек, но и в процессе деполимеризации одной микротрубочки (Рис.25А), как это наблюдалось и в эксперименте [122]. Скорость разборки микротрубочки вмодели, так же как и в эксперименте, показывает отсутствие выраженной зависимости отконцентрации тубулина в растворе (Рис.соответствуетмикротрубочки.экспериментальнымданным,25Б). Таким образом, данная модельописывающимростиукорочение63А.Б.Рис.
25. А. Примеры зависимости длины укорачивающейся микротрубочки от времени в модели,полученные с шагом сбора данных 2 мс. Б. Зависимость скорости укорочения микротрубочки отконцентрации тубулина. Теоретические значения отображают среднее ± ошибка среднего наосновании N ≥ 6 расчетов для каждой концентрации тубулина. Экспериментальные значениявзяты из [33,59,103].3.23.2.1Феномен «старения» в моделиНеэкспоненциальное распределение времен жизни микротрубочекСтохастические переходы микротрубочки от роста к укорочению достаточно редки: 0,0010,005 с-1 [103,44].
Даже с использованием суперкомпьютеров и параллельногопрограммирования на сегодняшний день не представляется возможным исследоватьповедение молекулярно-динамической модели на достаточно больших промежуткахвремени, чтобы наблюдать катастрофы. Для того, чтобы преодолеть это техническоеограничение, было ускорено наступление таких событий в модели путем увеличенияскорости гидролиза ГТФ Khydrol. В случае, когда этот параметр был увеличен в 6-18 раз,катастрофы в модели наблюдались на временах, уже доступных для вычислений (Рис. 26).640.0c2.4c4.8c7.2c7.5c7.8c8.1cРис.
26. Конфигурации микротрубочки с момента начала роста (0 с) до наступления катастрофы(7,5 с) и резкого укорочения. Зеленым цветом показаны ГДФ-димеры, светло-красным икоричневым – ГТФ. Бордовый участок микротрубочки внизу показывает стабильную ГТФнегидролизуемую затравку. Концентрация тубулина 10 мкМ, константа гидролиза 9,0 с-1. Вначалемикротрубочка растет с преимущественно тупым концом и время от времени появляютсяотгибающиеся протофиламенты. Когда их становится 10-13, наступает катастрофа имикротрубочка переходит в состояние укорочения, в ~10 раз более быстрого, чем рост.Времена жизни микротрубочки – это время с момента начала фазы роста до наступлениякатастрофы.
Полученные с помощью ускоренных констант гидролиза времена жизнибыли затем пересчитаны для реалистичной константы путем нормировки (см. параграф2.4.3 и Рис. 19). Подобный пересчет был основан на том свойстве, что частота катастрофв модели обратно пропорциональна скорости гидролиза на исследуемом диапазоне времен(Рис. 27А). Более того, нормированные распределения времен жизни микротрубочки,полученные с различными константами гидролиза, совпадали при наложении (Рис. 19В).65А.Б.Рис.
27 А. Время жизни микротрубочки (среднее ± стандартное отклонение) в зависимости отконстанты гидролиза Khydrol. Сплошная линия – аппроксимация гиперболой. График построен наосновании N = 551 события катастрофы. Для анализа катастроф было использовано значение Khydrol= 9 с-1. Б. Зависимость частоты катастроф от концентрации растворимого тубулина (среднее ±ошибка среднего, N=232). Для сравнения с экспериментальными данными времена жизнимикротрубочки были перенормированы (см. параграф 2.4.3).С использованием данного подхода было обнаружено, что частоты катастроф в моделизависели в незначительной степени от концентрации тубулина, что находится всоответствии с большей частью экспериментальных данных (Рис.
27Б).Делая расчеты с константой гидролиза Khydrol = 9 с-1, мы зарегистрировали в общейсложности 113 событий катастроф и соответствующие им времена жизни микротрубочек,которые затем были пересчитаны для реалистичной константы гидролиза. Удивительнымрезультатом было то, что в данной модели распределения времен жизни микротрубочкибыли не экспоненциальными, а имели четко выраженные максимумы, отстоящие от нуля(Рис.
28A).66А.Б.Рис. 28 А. Распределение времен жизни микротрубочки в модели при концентрации тубулина 10мкМ, N=113. Б. Зависимость частоты катастроф от времени для 10 мкМ тубулина.Экспериментальные значения взяты из [123]. Значения на графике (и теоретические, иэкспериментальные) были посчитаны по формуле, где– интегральнаяфункция распределения времени жизни микротрубочки, а– дифференциальная функцияраспределения. Стандартные отклонения теоретических значений на графике были оцененыметодом «bootstrapping» [124,125], в котором из набора данных в распределении делается nвыборок и оценивается стандартное отклонение для каждого диапазона (бина) гистограммы (n =100).Частота катастроф возрастала со временем с характерным временным параметром ~160секунд, совпадая с экспериментальными данными (Рис.
28Б).В модели увеличение концентрации тубулина имело больший эффект на распределениедлин микротрубочки перед катастрофой, чем на времена жизни (Рис. 29), как и былопоказано в эксперименте [44].Таким образом, динамика микротрубочек в расчетах описывает экспериментальныеданные по частотам катастроф и их концентрационным зависимостям.67А.Б.Рис. 29. А. Интегральные распределения времен жизни микротрубочки при различныхконцентрациях тубулина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
