Лазерная спектроскопия компонентов светоиндуцируемой ферментативной реакции (1103530), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Субстратом-регулятором является паранитрофениловый эфир пара-транс(цис)-нитрокоричной кислоты (транс(цис)-NPNC), продуктыфотогидролиза: п-нитрофенол (NP), пара-нитрокоричная кислота (NC). Концентрациирассчитаны относительно начальной концентрации транс-NPNC13На основании этих спектров сделан вывод о возможном протекании побочной реакциипри облучении. С помощью методов ЯМР-спектроскопии и жидкостной хроматографиипроизведена идентификация компонентов раствора, появляющихся в результатеоблучения.
Показано, что в результате облучения субстрата-регулятора лазернымизлучением происходит транс-цис изомеризация субстрата (преобразование субстратарегулятора в необходимую для реализации светоиндуцируемой ферментативной реакцииформу) и фотогидролиз субстрата. На основании полученных результатов разработанаметодика контроля состава раствора субстрата и определения концентраций компонентовраствора субстрата-регулятора светоиндуцируемой ферментативной реакции по егоспектру поглощения.С использованием предложенного метода контроля состава раствора полученызависимости относительных концентраций компонентов от дозы облучения (рис. 5)лазерным излучением четырех длин волн.
Определено, что из четырех использованных вэкспериментах длин волн длина волны излучения 325 нм обеспечивает максимальноепреобразование субстрата-регулятора в необходимую для реализации светоиндуцируемойферментативной реакции форму: при дозе облучения 6 МДж/моль 55% исходногосубстрата преобразуется в необходимую форму (таблица 1).Дляприменениярастворасубстрата-регуляторасветоиндуцируемойферментативной реакции наличие в составе продуктов фотогидролиза не являетсясущественным, так как после формирования фермент-субстратного комплекса возможнаочистка реакционной смеси.Таблица 1. Максимальные относительные концентрации цис-NPNC.Длина волны облучения, нм266308325355Отношение максимальнойконцентрации цис-NPNC к0.40±0.05 0.50±0.05 0.55±0.05 0.45 ±0.05начальной концентрации NPNCДоза, необходимая для получениямаксимальной концентрации162466цис-NPNC, МДж/мольИзмерены КР спектры компонентов модельной системы фермент-субстрат напримере белка-фермента α-химотрипсина и светочувствительного субстрата-регуляторапара-нитрофениловогоэфирапара-нитрокоричнойкислоты(NPNC),атакжерастворителей и продуктов фотогидролиза.
На основании полученных КР спектров14определено, что использование КР спектроскопии для контроля состава растворовсубстрата-регулятора NPNC во время облучения является неоправданным из-за низкойчувствительности КР спектроскопии к наличию продуктов распада.В КР спектре фермента, находящегося в составе фермент-субстратного комплекса,выявлены спектральные диапазоны, не перекрывающиеся резонансами растворителей илисубстрата и соответствующие конформационно-чувствительным полосам фермента. Этодиапазон 650-700 см-1, соответствующий колебаниям C-S групп белка, диапазонтирозинового дублета (835 и 860 см-1), а также диапазон, соответствующий амиду III(1230-1330 см-1).В КР спектре фермента, находящегося в составе фермент-субстратного комплекса(ацилфермента), выявлены изменения конформационно-чувствительной полосы амид III.Так, линия с центром 1245 см-1, соответствующая колебаниям β-структурных участковфермента и наблюдающаяся в КР спектре несвязанного фермента, в КР спектреацилфермента практически исчезает.
При этом в спектре ацилфермента появляетсяинтенсивная линия с центром 1290 см-1, соответствующая, по разным данным,колебаниямα-спиральныхилинеупорядоченныхучастковбелковоймолекулы.Следовательно, в результате формирования фермент-субстратного комплекса вовторичной структуре фермента происходят значительные изменения.Таким образом, в пятой главе охарактеризован метод управления субстратомрегулятором светоиндуцируемой ферментативной реакции. Этот метод может бытьприменён в экспериментах по изучению функционирования фермента α-химотрипсина.Показано, что КР спектроскопия может быть использована в качестве методаопределения структурных изменений в системе фермент-субстрат при фотоуправленииферментативной реакцией.В разделе Заключение сформулированы основные результаты и выводыдиссертационной работы:1.Интенсивность широкополосного фона в КР спектрах водных растворов белков ихарактерное время фотообесцвечивания при отсутствии флуоресцирующих примесейи флуоресценции растворителя зависят от конформационного состояния белка.152.Наличие эффекта фотообесцвечивания растворов биополимеров свидетельствует одеструктивном воздействии видимого лазерного излучения на биомолекулы.
Приэтом видимое лазерное излучение не оказывает влияния на аминокислотный состав ине вызывает существенных изменений во вторичной структуре биополимеров.3.Осцилляции интенсивности широкополосного фона в КР спектрах растворовбиомолекул могут возникать вследствие осцилляций тепловой линзы, которые всвою очередь определяются процессами тепло- и массопереноса в образце.4.С использованием спектроскопии оптического эффекта Керра, индуцированногокомбинационным резонансом, получены спектры водного раствора белка вдиапазоне от -4 до 4 см-1.5.Влияние растворителей на низкочастотные колебательные резонансы модельныхвеществ выражается в сдвиге, уширении и изменении формы линии.
Данныеизменения не могут быть объяснены только изменением эффективного трения всреде вследствие влияния растворителя.6.Охарактеризованметодлазернойподготовкисубстрата-регулятораNPNCсветоиндуцируемой ферментативной реакции, который может быть применён вэкспериментах по изучению динамических свойств фермента α-химотрипсина вовремя его функционирования. Из четырех использованных в эксперименте длин волнлазерного излучения облучение на длине волны 325 нм позволяет достичьмаксимальной относительной концентрации необходимойформысубстрата-регулятора при дозе облучения 6 МДж/моль.Список публикаций по теме диссертацииНаучные статьи:1.2.A.F. Bunkin, A.Yu. Chikishev, A.P.
Gorchakov, S.I. Lebedenko, A.A. Nurmatov,S.M. Pershin. Four-photon spectroscopy of α-chymotrypsin protein aqueous solution insubterahertz range from –4 to 4 cm–1 // Physics of Wave Phenomena, 2004, v. 12, № 4, p.175–179.N. R. Arutyunyan, N. N. Brandt, A. Yu. Chikishev, S. I. Lebedenko, andYu.M. Romanovsky. Nature of the Broadband Background in Raman Spectra of AqueousSolutions of α-Chymotrypsin // Laser Physics, 2004, v. 14, № 8, p. 1054.163.4.5.6.7.8.9.N. N.
Brandt, A. Yu. Chikishev, A. I. Chulichkov, P. A. Ignatiev, S. I. Lebedenko, and O.V. Voronina. A Method of Comparing Raman Spectra // Laser Physics, 2004, v. 14, № 11,p. 1386.А.Ф. Бункин, С.И. Лебеденко, А.А. Нурматов, А.Ю. Чикишев, С.М. Першин.Четырехфотонная спектроскопия водного раствора α-химотрипсина в терагерцовомдиапазоне от 10 до -100 см-1 // Оптика и Спектроскопия, 2005, т. 99, № 4, с. 601-605.N.R. Arutyunyan, N.N. Brandt, A.Yu.
Chikishev, S.I. Lebedenko, O.D. Parashchuk andA.D.Razzhivin. Broadband Background in Raman Spectra of Proteins: DeterministicSignal or Noise? // Fluctuation and Noise Letters, 2005, v. 5, № 5, p. L233.A.F. Bunkin, A.A. Nurmatov, S.M. Pershin, S.I. Lebedenko. Low-Frequency Four-PhotonSpectroscopy Of Tetrachloroethane And Tetrabromoethane Molecule Rotations InLiquid Phase // Physics of Wave Phenomena, 2006, v. 14, № 2, p. 87-91.А.Ф. Бункин, С.И. Лебеденко, А.А.
Нурматов, С.М. Першин. Четырехфотоннаяспектроскопия крыла Рэлея водного раствора белка α-химотрипсина // Квантоваяэлектроника, 2006, т. 36, №7, с. 612-615.N. N. Brandt, A. Yu. Chikishev, V. I. Dolgovskii, and S. I. Lebedenko. Laser RamanSpectroscopy of the Effect of Solvent on the Low-Frequency Oscillations of OrganicMolecules // Laser Physics, 2007, v. 17, № 9, p. 1133–1137.N. N. Brandt, O. O. Brovko, A.
Yu. Chikishev, K. Itoh, S. I. Lebedenko, V.I. Polshakov,and I. K. Sakodynskaya. Laser Control of the Structure of a Photosensitive Substrate forEnzymatic Reaction // Laser Physics, 2007, v. 17, № 9, p. 1154–1157.Тезисы докладов:1.2.3.4.5.6.7.N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, S.I. Lebedenko. Simulation of Protein SolutionPhotobleaching Kinetics. // Book of abstracts, ABC, Тhailand, 3-7 February, 2003, p. 64.N.N. Brandt, A.Yu.
Chikishev, S.I. Lebedenko. Laser Scattering Spectroscopy As Means toMeasure Thermodiffusion of Proteins. // Book of abstracts, ECSBM, Hungary, 30 August –4 September, 2003, p. 48.N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, S.I. Lebedenko. Laser Raman Spectroscopy of Proteins:Problem of the Broadband Background.
// Book of abstracts, ITARUS, Russia, 29 October- 2 November, 2003.Н.Н. Брандт, С.И. Лебеденко, А.Ю. Чикишев. Модели фотообесцвечиваниярастворов биомолекул // Сборник тезисов, Международная научная конференциястудентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2003”, Россия, Москва, 2003.N.R. Arutyunyan, N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, S.I. Lebedenko, O.D. Parashchuk.Broadband background in Raman spectra of proteins: deterministic signal or noise? // Bookof abstracts, International Workshop on Noise in Condensed Matter and Complex Systems,Italy, 26-29 July, 2004, p.
14.A.F.Bunkin, A.P.Gorchakov, A.A.Nurmatov, S.M.Pershin, A.Yu. Chikishev,S.I. Lebedenko. Four-photon Rayleigh wing spectroscopy of water and the aqueoussolution of protein // Book of Abstratcs, ICONO, Russia, 11-15 May, 2005, p. 106.N.N.Brandt, A.Yu Chikishev, S.I.Lebedenko, I.K.Sakodynskaya.
Laser induced trans-cistransformation of p-nitrophenyl ester of trans-4-nitrocinnamic acid. // Book of abstracts,European Congress on molecular spectroscopy, Turkey, 3-8 September, 2006, p.289.178.N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, V.I.
Dolgovskii, S.I. Lebedenko. Low-frequency Ramanspectroscopy of macromolecules // Book of Abstracts, Workshop on Biophotonics andMolecular Simulations, Slovakia, 9-12 September, 2006, p. S2-B3.9. N.N. Brandt, O.O. Brovko, A.Yu. Chikishev, S.I. Lebedenko, I.K. Sakodynskaya, V.I.Polshakov. Laser activation of photosensitive substrate for enzymatic reaction withchymotrypsin.
// Book of Abstratcs, ICONO, Belarus, 28 May -1 June, 2007.10. N.N. Brandt, O.O. Brovko, A.Yu. Chikishev, S.I. Lebedenko, I.K. Sakodynskaya, V.I.Polshakov. Laser control of enzymatic reaction: Raman and absorption spectroscopy. //Book of Abstracts, LALS, Russia, 11-14 June, 2007.11. N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, V.I. Dolgovskii, S.I. Lebedenko. Effect of Solvent on theLow-Frequency Vibrational Resonances in Raman Spectra of Organic Molecules // Bookof Abstracts, LALS, Russia, 11-14 June, 2007.12. N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, V.I. Dolgovskii, A.V.
Kargovskii, S.I. Lebedenko. Lowfrequency Vibrational motions in proteins: physical mechanisms and effect on functioning// Book of Abstracts. International Workshop on Ecological Complex Systems: StochasticDynamics and Patterns. Italy, Palermo, 2007, p. 12.18.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
