Диссертация (1102418), страница 3
Текст из файла (страница 3)
срецепторами Dectin-1 и TLR-6, может быть использована в качестве основыдля интерпретации экспериментаальных данных.Научная новизна диссертационной работыВпервыеполученбиологическиактивныйвысокоочищенныйполисахарид из Helianthus tuberosus L. на основе глюкозы, галактозы иуроновых кислот. Установлено, что его биологическое действие зависит отналичия β-глюкановой части в составе гетерополисахарида.Впервые определены биофизические характеристики HTLP:12в ИК-спектре присутствуют характерные для полисахаридов полосыпоглощения; полоса в области 1148 cм–1 и характерны для β-гликанов;в УФ-спектре присутствует пик поглощения в области 280 нм,характерный для белков. Определение количества белка методом Лоурипоказало содержание до 0,5% белка, что было подтверждено и другимиметодами исследования;полисахарид имеет молекулярную массу 1–2 МДа со следующиммоносахаридным составом: Glc – 30%, GalA – 23%, GlcA – 15%, Gal – 13%,Rha – 6%, Ara – 4%, Man – 3%, Xyl – 2%;по данным ЯМР-анализа структура HTLP сильно разветвлена ихарактеризуется наличием вставок экспонированных наружу β-глюканов,обеспечивающих связывание с рецепторами, а также β-(1→3), так и β-(1→4)связей, критичных для проявления биологических активностей.В результате исследований биологической активности установлено:полисахарид является нетоксичным и не аллергенным протектором,интерферониндуцирующим агентом, способен стимулировать выработкуTNF-α и IL-6, а также регулировать уровень IL-1;при внутривенном введении полисахарида выживаемость подопытныхмышей при летальном кратковременном лучевом воздействии в 800 радсоставляла до 95%;полисахаридявляетсяколониестимулирующимвеществом,чтоустановлено в тесте на колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕ-C) –колониеобразование спленоцитов во всех подопытных группах выросло в2,0–2,3 раза по сравнению с контрольной группой;применениеполисахаридавмоделигерпетическогоменингоэнцефалита у мышей приводило к выраженному профилактическомуили терапевтическому действию как в сравнении c контролем, так и всравнении c фармакопейным препаратом – ацикловиром.
При дозе вируса10ЛД50 защитный эффект составлял 50–60%, а c ацикловиром – 15%; а придозе 100ЛД50 – 57–63% при отсутствии эффекта у ацикловира;13обнаружено влияние HTLP на NK клетки в виде стимуляции иувеличения цитотоксического индекса на 15% по сравнению с контролем;установлено, что полисахарид проявлял свои противоопухолевыесвойства и в антиметастатической модели, и в модели торможения ростаопухоли.В экспериментах по инактивации целевых рецепторов показано, чтополисахарид активирует клетки опосредованно, через взаимодействие срецепторами Dectin-1, TLR-6.Установлено, что оба рецептора необходимы для активации клеток спомощью HTLP, что подтверждается экспериментальными данными двухмоделей: блокировки рецепторов антителами и инактивации генов целевыхрецепторов.Моделированиепоказаловозможностьвозникновениявтрансформированной клетке бифуркационного состояния выбора междуапоптозомипролиферацией,котороеобусловленовзаимодействиемполисахарида с рецепторами клетки Dectin-1 и TLR-6.Теоретическая и практическая значимостьРезультаты исследований позволяют включить биологически активныйполисахарид из Helianthus tuberosus L.
в группу уже охарактеризованныхполисахаридов, выделенных из различных источников. Разработана методикаполученияизрастительногопротивометастатической,сырьяполисахаридногопротивовирусной,препаратасрадиопротекторной,колониестимулирующей и иммуномодулирующей активностями.Модель бифуркационного изменения состояния трансформированнойклетки и полученные новые данные о полисахаридах из Helianthus tuberosusL. могут быть использованы для создания и тестирования in silico на ихоснове новых лечебных и профилактических препаратов для медицины иветеринарии.14Личный вклад автора состоял в планировании и проведенииэкспериментов, а также в анализе полученных данных, выборе иформулированиитемыдиссертационногоисследования,подготовкепубликаций и выступлений.
Все изложенные в диссертации новыерезультаты получены автором лично или при его непосредственном участиив подготовке экспериментов.Апробация результатов. Материалы диссертации докладывались наIV Международной междисциплинарной конференции «Современныепроблемы системной регуляции физиологических функций» (г. Москва, 2015г.) и VIII Международной Научной Конференции SCIENCE4HEALTH2017 (г.Москва, 2017).Методология и методы исследованияВработебылииспользованыразличныехроматографическиеметодики: газо-жидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостнаяхроматография,инфракраснаягельпроникающаяспектроскопия,хроматография;ультрафиолетоваяспектроскопические:спектроскопия,ЯМР-спектроскопия; обработка ферментами, тесты на биологическую активность:противовируснуювмоделигерпетическогоменингоэнцефалита;противоопухолевую (ингибирование роста опухоли и антиметастатическаяактивность) как in vivo, так и in vitro: на клеточных культурах L-929, Hep-2,на мышиных моделях легочной карциномы Льюиса и карциносаркомыУокера;радиозащитнуювмоделяхабсолютнойвыживаемостииколониестимуляции; иммуномодулирующую на примере уровней продукцииTNF-α, IL-1β, IL-6, IFN, стимуляции активности натуральных киллеров истимуляции продукции антител; тест на цитотоксичность в модели RAW264.7; трансфецирование упаковочными плазмидами GAG, REV, VSVG иконечными вирусными стоками с олигонуклеотидами, комплементарными кгенам рецепторов CLEC7A, TLR-6, CR3; обработка антителами к рецепторам15CLEC7A, TLR-6, CR3.
Для рассмотрения бифуркационных процессов вклетке использовалось уравнение ФитцХью-Нагумо и подход Ляпунова.Степень достоверности и апробации результатовПо теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 7статей, из которых 5 статей в рецензируемых научных изданиях,индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, RSCI, 2 тезисов и 1монография.Структура и объем работыДиссертационная работа состоит из введения, трех глав, обсуждения,выводов и списка литературы.
Объем диссертации составляет 192 страницытекста, включая 26 рисунков и 28 таблиц. Список использованнойлитературы содержит 308 наименований.161. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫВ природе полисахариды могут быть найдены почти во всех живыхорганизмах, в том числе в тканях семян, стеблей и листьев лекарственныхрастений,жидкостяхорганизмаживотных,клеточныхстенкахивнеклеточной жидкости бактерий, дрожжей и грибов [31].
С развитиеммолекулярной биологии научное сообщество пришло к выводу, чтополисахариды,наравнесбелкамииполинуклеотидами,являютсячрезвычайно важными биомакромолекулами, которые играют незаменимуюроль в росте и развитии живых организмов [32].Исследование природных полисахаридов важно, прежде всего, из-за ихроли в регуляции молекулярных и клеточных процессов, понимание которойтребует знания их физико-химических характеристик и структурнофункциональных отношений.Однако изучение структуры и активностей полисахаридов весьмазатруднительно. Проблема, прежде всего, связана с отсутствием стандартныхпрепаратов полисахаридов.
Отсутствие стандартных протоколов выделения,очистки и определения структурных характеристик мешает правильномусопоставлению структуры и функциональной активности. Достаточно многоиммунологическихисследованийбылопроведеноснеочищеннымиэкстрактами, только обогащенными полисахаридами. Таким образом,наличие других соединений, таких как полифенолы [33], белки [34] илилипополисахаридов (LPS) [35], могло влиять на определение активности.Наличие смесей различных полисахаридов в одних и тех же образцах можетмаскироватьилииндивидуальнойвлиятькомпонентынаиммуностимулирующую[36].Втакихслучаяхактивностьметодологияфракционирования, химические и структурные характеристики [37] являютсяважными шагами получения чистых образцов полисахаридов для изученияверных структурно-функциональных взаимосвязей.Так, например, в случае β-D-глюканов, несмотря на общую для всеххимическуюформулу(1→6);(1→3),17обнаруживаютсясущественныеразличия в длине полисахаридной цепочки, количестве боковых ответвлений,молекулярном весе, заряде, третичной структуре, растворимости, наличии(1→4)-гликиозидных связей и др.
В связи с этим возникает проблема из-заотсутствия стандартных препаратов β-D-глюкана.При выделении и очистке полисахаридов исследователи сталкиваютсятакже с проблемой малой прочности цепочек, изменением боковыхрадикалов моносахаридов и т.д. С развитием техники и методологииисследования появились новые возможности для описания даже такихсложных молекул, как полисахариды.Классификация и строение углеводов1.1.В настоящее время углеводы подразделяются на три большиеподгруппы: моносахариды (простые сахара), олигосахариды и полисахариды.Классификация производится по степени полимеризации и длине углеводнойцепи. Моносахариды определяют как производные от многоатомных спиртовскарбонильнойгруппой.Ихстепеньполимеризации–единица.Моносахариды содержат от трех (глицеральдегид) до девяти (3,4 кеталь-Dгалактоза) атомов углерода и только одну альдегидную или кетоннуюгруппу,тоестьсостоятизоднойполиоксиальдегиднойилиполиоксикетонной единицы.
В зависимости от положения карбонильнойгруппы моносахариды делятся на альдозы и кетозы: у альдоз она раположенав конце цепи, у кетоз − в любом другом положении. В зависимости отколичества атомов углерода моносахариды также часто подразделяются натриозы − три атома, пентозы − четыре атома и так далее.Полисахаридыпредставляютсобойполимерныеуглеводныемакромолекулы, состоящие из длинных цепей моносахаридных единиц,соединенных гликозидными связями [38]. Они имеют огромное разнообразиев структурах, начиная с линейной и заканчивая сильно разветвленной. Естьдва типа полисахаридов: гомополисахариды, содержащие только один типмоносахарида, и гетерополисахариды, состоящие из двух или более типов18моносахаридов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
