Диссертация (1102418), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Рецепторный комплекс TLR6/TLR-2 взаимодействуя с HTLP также приводит к передаче сигнала по NFκB-пути, опосредованно через TIRAP-Myd88, IRAK4, IRAK1/2 и TRAF6(рисунок 4, 7 и 26).147Рисунок26.СигнальныепутиDectin-1,TLR-6,TNFR,IFNR[модифицирована первоначальная схема из 205].Во-вторых, возможно первичное связывание с одним из рецепторов:Dectin-1 или TLR-6, после чего происходит димеризация рецепторов иливторичноесвязываниес другим рецептором.Приэтомпервичноесвязывание, скорее всего, происходит с рецептором Dectin-1, а не TLR-6, потой причине, что активация комплекса TLR-6/TLR-2 приводит к запускупроапоптотического каскада по CASP8-пути, что должно приводить к гибеликлеток.
Тем не менее, гибели клеток в экспериментальной моделиколониестимулирующей активности не наблюдается, наоборотHTLPявляется колониестимулятором, что связано с совместной активацией TLR-6полисахаридом и TNF-R1 лигандом. Такое взаимодействие приводит ксмещениювнутриклеточногосигнальногопутивсторонупротивоапоптотического TRADD-сигнального каскада посредством TIRAPMyd88 и мобилизации RIPK и TRAF2.
Последняя, в свою очередь,взаимодействует с протеинкиназой IKK, что позволяет серин-треониновойкиназе RIPK активировать NF-κB. Белок IκBα, находящийся в комплексе с148NF-κB, ингибирует его транслокацию, происходит фосфорилирование IKK ипоследующаядеградациясвысвобождениемNF-κB,которыйтранслоцируется к ядру и опосредует транскрипцию множества белков,участвующих в выживании и пролиферации клеток, воспалительной реакциии синтезе антиапоптотических факторов. В дополнении к этому TNF-α можетусиливать пролиферацию клеток по сигнальному пути JNK с активацией AP1. Однако, учитывая совместную активацию TLR-6 и Dectin-1, активация,скорее всего, идет по NF-κB-сигнальному пути (рисунок 4, 7 и 26). Вместе стем, следует отметить, что инфламмасомный способ активации макрофагов,изучаемый в настоящее время [303], скорее всего, не реализуется в силу того,что CR3 рецептор не участвует во взаимодействии с HTLP.В-третьих, существует вероятность существования некоего стороннегорецептора, для которого HTLP является лигандом, но при этом и Dectin-1, иTLR-6 необходимы для активации внутриклеточного каскада.
Однакочетырехкомпонентная система активации клеток даже молекулой с большоймолекулярной массой представляется маловероятной в силу того, чтомногокомпонентные системы менее устойчивы. С другой стороны, учитываявремя наработки TNF-α – 4 часа – и скорость миграции рецепторов напримере Т-клеток с одного полюса клетки к другому – 3,6–18 мкм/час [304],можнопредположить,чтопроисходитбыстраяактивацияклеткиполисахаридом, после чего комплекс полисахарид-рецепторы распадается имолекула полисахарида постепенно деградирует в растворе.Любой из описанных выше путей взаимодействия полисахарида срецепторами приводит к повышенной выработке TNF-α, что и было показанона двух различных моделях. Кроме того, модуляция уровня IL-1β истимуляциявыработкиIL-6,позволяютпредположитьстабилизациюдинамического равновесия системы между про- и противовоспалительнымответом клетки при наличии воспалительных факторов. Совместное жедействие IL-1 и TNF-α, а также p50-p65, приводит к образованию петлиположительной обратной связи по NF-κB-сигнальному пути.
При этом IL-6149совместно с TNF-α может вызывать как апоптоз, так и пролиферацию клетокв зависимости от активности AKT, которая ингибирует ASK1 и MKK4. TNFα может активировать AKT-киназу, при этом происходит ингибированиеапоптоза. Другой способ регулирования активности AKT происходит сучастием CR3, который при наличии патогена способствует ингибированиюAKT, что приводит к подавлению активности ASK1 и MKK4 и запускупроапоптотического сигнального пути.Интерферониндуцирующая активность HTLP, по-видимому, такжесвязана с активацией Dectin-1 и TLR-6 рецепторов, которые при активации намиелоидных и плазмацитоидных дендритных клетках приводят к ихтрансформации в Т-reg с повышенной продукцией IL-17 [305], на CD4 Tклетках – к запуску выживаемости и активации противогрибковогоиммунитета, на плазматических клетках – к созреванию до B- клеток, а их всвою очередь до плазмобластов, с повышенной выработкой антител, а такжена NK клетках – к активации противоопухолевого действия иммуннойсистемы [306].
Более того, в макрофагах и нейтрофилах IFN-γ активируетNADP-оксидазы, повышенную продукцию NO и лизосомальных ферментов.При участии этих двух рецепторов происходит не только увеличениевыработки цитокинов, но и активация макрофагов, нейтрофилов, моноцитов,Т-клеток и дендритных клеток, что, в конечном итоге, приводит кповышенной противомикробной и противовирусной активности этих клеток[307], что и было обнаружено в опыте по противовирусной активности HTLP.Противоопухолевое действие HTLP проявлялось в различных моделях.Применение HTLP при метастазировании предположительно активируетиммунный ответ и стимулирует действие NK и Т-клеток, ответственных запротивораковый иммунитет.
NK-клетки действуют на трансформированныеклетки с повышенным содержанием N-гликанов на поверхности, которыезапускают активацию IRF5 транскрипционного фактора через Dectin-1,который стимулирует полноценное онколитическое действие NK-клеток[308]. Поэтому совместная активация NK-клеток через Dectin-1 и TLR-6150будет приводить к торможению роста первичной опухоли и метастазов,который наблюдается при использовании HTLP. При этом цитокины TNF-α,а также IL-1 и IL-6, могут стимулировать дифференцировку или апоптозтрансформированных клеток.
Вместе с тем, INF-γ стимулирует миграциюиммунных клеток к месту воспаления – трансформированным клеткам, засчет повышения выработки хемокинов и факторов адгезии, а в местевоспаления – расширяя сосуды вместе с NO. Повышенные концентрациипоследнего при этом приводит к лизису онкологических клеток. Такаяактивность INF-γ обладает синергизмом с цитокинами IL-1β и TNF-α [307].В моделях in vitro также наблюдалось торможение роста опухолей, чтопредположительно связано с повышенной выработкой IL-1β, IL-6, а такжеIFN-γ, экспрессию которых запускал либо HTLP через интернализацию иливзаимодействие с рецепторами, либо продукты его распада.
При этомповышенная выработка этих цитокинов в моделях in vitro также можетприводить к апоптозу онкологических клеток.Теоретическимииэкспериментальнымипостроения биофизическойпредпосылкамимодели являются следующиедляположения.Полисахарид HTLP является высокомолекулярным соединением 1–2 МДа,состоит в основном из глюкозы – 30%, галактозы – 23%, и глюк- игалактуроновых кислот – 15% и 13%, соответственно. Более того, (1→3) и(1→4)гликозидныеполисахаридомопределено,чтоегосвязиявляютсябиологическойбиологическаяосновнымиактивности.активностьвдляТакжемоделипроявленияранеебылосинтезаTNFмакрофагами RAW 264.7 проявляется за счет взаимодействия с двумярецепторами Dectin-1 и TLR-6.
Вместе с тем, при добавлении HTLP кклеточным культурам в различных онкологических моделях – на клетках L929 и Hep-2 – наблюдалось торможение клеточного роста, которое не связанос прямым цитотоксическим действием полисахарида.Вместе с тем в автоволновой модели наблюдалось, что по мереактивациисистемыпроисходит151частичноеперераспределениеинтенсивностей противо- и проапоптотических сигналов за счет связываниячасти ингибиторов адапторных белков, участвующих в передаче сигнала,приводящего к апоптозу клетки.
Благодаря механизмам обратной связи ипротивоапоптотическим сигналам, передающимся в геном по пути через NFκB, возрастает вероятность обратного переключения клетки, т.е. еевыживания. На больших временах количество рецепторов, связанных с HTLPи TNF, уменьшается за счет деградации, что приводит ко второмупереключению поведения клетки и ее выживанию. При этом переключениевозможных форм поведения клетки – выживание или переход к апоптозу –становится цикличным.152ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ1. Впервые экстрагирована, очищена и охарактеризована биологическиактивнаянепирогеннаяфракцияполисахаридовизHelianthustuberosus L., которая содержит гетеро-β-гликан HTLP с молекулярноймассой 1–2 МДа, содержащий 0,5% белка и боковые вставки β-(1→4)и β-(1→3)-глюканов, определяющих биологическую активностьмолекулы.2.
Показано, что HTLP – иммунологически активный полисахарид,который активирует клеточный иммунитет, цитотоксические Тлимфоциты, макрофаги и естественные киллеры, стимулируетвыработку TNF-α и IL-6 и модулирует – IL-1. При этом он не обладаетцитотоксичностью,индукторомпроявляетинтерферона,адъювантныеобладаетсвойства,являетсярадиопротекторнымииколониестимулирующими свойствами.3. Установлено, что HTLP не стимулирует выработку TNF-α в культурахс выключенными генами рецепторов TLR-6 и Dectin-1.
Инактивациягена целевого рецептора CR3 не сказывается на выработке TNF-αмакрофагальными клетками. Аналогичные данные получены в моделиблокировкицелевыхрецептороввысокоспецифичнымипроявляетсвоюCR3,моноклональнымибиологическуюTLR-6иантителами.активностьDectin-1HTLPпосредствомвзаимодействия с обоими рецепторами Dectin-1 и TLR-6, но не с CR3.4. Построена биофизическая модель формирования бифуркационногосостояния клетки при воздействии полисахарида на клеточныерецепторы Dectin-1 и TLR-6 на основе уравнения ФитцХью-Нагумо.Показанавозможностьцикличностипереключениймеждуразличными формами клеточных ответов на внешнее воздействие.153СПИСОК СОКРАЩЕНИЙAG – арабиногалактанAPI – апиозаAPS – полисахарид из A.
membranaceusAra – арабинозаCI – индекс цитотоксичностиCR – рецептор комплементаCRD – углевод-распознающий доменCTL – с-тип лектиновыеCTLR – с-тип лектин-подобный рецепторDMEM –DNP – полисахарид из D. nobileDPPH – 1,1-дифенил-2 пикрилгидразилаFBS – фетальнаябычья сывороткаGal – галактозаGalA – галактуроновая кислотаGalpA – галактопиранозильная кислотаGlc (Glu) – глюкозаGlcA – глюкуроновая кислотаGlcNAc – N-ацетилглюкозаминHBS – hepes buffered salineHEPES – 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислотаHTLP – полисахарид из Helianthus tuberosus L.iE-DAP – D-γ-глутамил-мезо-ДАП дипептидIFN – интерферонIL – интерлейкинiNOS – индуцибельная синтаза окиси азотаLAL – Limulus amebocyte lysateLPS – липополисахаридLRhap – рамнопиранозильные остатки154LRR – лектин богатый рецепторMan – маннозаMDA – малондиальдегидаMIDAS – ион-зависимый металл-связывающий сайтMW – молекулярная массаNK – натуральные киллерыNLR – нодд-подобный рецепторNO – окись азотаoxLDL – окисленный липопротеин низкой плотностиPBS – фосфатно-солевой буферPFC – бляшкообразные клеткиPSK – полисахарид-KRG – рамногалактуронанRha – рамнозаROM – реактивные метаболиты кислородаshРНК – small hairpin RNA, малая шпилечная РНКSR – рецептор «мусорщик»Th – Т-хелперыTLR – лолл-подобный рецепторTNF – фактор некроза опухолейTyv – тивелозаVSV-G – белок оболочки вируса везикулярного стоматитаXyl – ксилозаАОК – антителообразующие клеткиАТФ – аденозинтрифосфатАФК (ROS) – активные формы кислородаБГО – β-глюкан овсаВБН – вирус болезни НьюкаслаВПГ – вирус простого герпесаВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография155ГПХ – гельпроникающая хроматографияЖХВД – жидкостная хроматография высокого давленияКОЕ-С – клетки: колониеобразующие единицы в селезенкеКТР – коэффициент торможения роста опухолиЛД – летальная дозаЛПК – лимфоциты периферической кровиМПК – мононуклеары периферической кровиМТТ – 3,4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолияММ – молекулярная массаСЭА – стафилококковый энтеротоксин АТЦД – тканевая цитопатогенная дозаЭБ – эритроциты барана156БИБЛИОГРАФИЯПУБЛИКАЦИИ АВТОРА В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ НАУЧНЫХИЗДАНИЯХ, ИНДЕКСИРУЕМЫХ В БАЗАХ ДАННЫХ WEB OFSCIENCE, SCOPUS, RSCI, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕДИССЕРТАЦИИ1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
