Автореферат (1102417), страница 4
Текст из файла (страница 4)
В свою очередь HTLP не стимулирует выработку TNF-α в культурах свыключенными генами рецепторов TLR-6 и Dectin-1 в пределах погрешности, что можетсвидетельствовать о том, что для HTLP необходимы оба рецептора для корректнойактивации клеток и выработки TNF-α. Учитывая значительную молекулярную массуHTLP, можно предположить, что активация происходит путем одновременногосвязывания обоих рецепторов, TLR-6 и Dectin-1, что обуславливает действие HTLP наклеточные системы.16Рисунок120100805.ДиаграммасравненияуровнейвыработкиTNF-αФиз.растворклеточной60LPS264.7 с инактивированными40HTLPгенами целевых рецепторов20CR3,0Без выключенияCR-3TLR-6линииDectin-1RAWиTLR-6через 4 ч инкубации.Dectin-1Блокирование рецепторов антителами и продукция TNF-α.
Так же, как и в моделивыключения генов, полученные данные демонстрируют, что HTLP стимулируетвыработку TNF-α, при этом уровень стимуляции сравним с липополисахаридом. Болеетого, было подтверждено участие двух рецепторов – Dectin-1 и TLR-6 – в активацииклеток при помощи HTLP (рисунок 6).Рисунок160,00140,00120,00100,0080,0060,0040,0020,000,006.сравненияДиаграммауровнейФиз.растворвыработки TNF-α клеточнойLPSлинииHTLPинактивированными генамиRAW264.7сцелевых рецепторов CR3,БезвыключенияCR-3TLR-6Dectin-1 и TLR-6 через 24Dectin-1120,00часа инкубации.100,00Рисунок80,00Физ. раствор60,0040,0020,00сравненияБезобработкиантителамиCR3TLR-6Dectin-1ДиаграммауровнейLPSвыработки TNF-α клеточнойHTLPлинии RAW 264.7 послеобработки0,007.антителамицелевых рецепторов TLR-6,CR3 и Dectin-1 через 4 часаинкубации.На рисунках 8–10 приведены рассчитанные зависимости интенсивностей противо- ипроапоптотических сигналов от координаты для различных интервалов времени.
Значенияu и v при x = 1 определяют вероятности экспрессии факторов регуляторной сети,ответственных за переход клетки либо в предапоптотическое состояние, либо в состояние,17соответствующее ее выживанию. Максимумы распределения u и v по x соответствуюткоординатам узлов сети, несущих наибольшую нагрузку в формировании сигналов вданный момент времени.РисунокПространственное8.распределение интенсивностей про- ипротивоапоптотических сигналов наначальныхстадияхпереноса.Вероятность выживания клетки вышевероятностипереходавпредапоптотическое состояние.РисунокПространственное9.распределение интенсивностей прои противоапоптотических сигналовна промежуточных стадиях переноса.Вероятностьпереходапредапоптотическоеклеткивсостояниепревышает вероятность выживания.Рисунок10.Пространственноераспределение интенсивностей прои противоапоптотических сигналовна больших временах.
Вероятностьвыживания клетки снова превышаетвероятностьпереходавпредапоптотическое состояние, но вконцециклаэтивероятностипрактически совпадают.На малых временах (t < 0,18) интенсивность противоапоптотического сигнала,поступающего в геном, выше интенсивности проапоптотического сигнала, и вероятностьвыживания клетки больше вероятности гибели (рисунок 8). Передача проапоптотическогосигнала в геном приводит к увеличению экспрессии TNF и TNFR1, что, в свою очередь,приводит к увеличению вероятности формирования каспазного проапоптотическогокомплекса и переключению клетки на путь к предапоптотическому состоянию илиапоптозу. Миграции TNF и TNFR1 к мембране и формированию их комплексовсоответствует пространственное расширение проапоптотического сигнала на рисунке 10.Если связывание лиганда с рецептором, приводящее к наработке TNF и TNFR1,18достаточнопродолжительно(t>0,25),товероятностьпереходаклеткивпредапоптотическое состояние превышает вероятность выживания (рисунок 9).
Если жеклетка изменена недостаточно, и ее компенсаторные (регуляторные) механизмы работаютнормально, то вероятна ситуация, при которой клетка выживет, нивелировав воздействиеHTLP. Такой ход событий наблюдается в экспериментах с нормальными клетками,например, мононуклеарах периферической крови доноров.Помереактивациисистемыпроисходитчастичноеперераспределениеинтенсивностей противо- и проапоптотических сигналов за счет связывания частиингибиторов адапторных белков, участвующих в передаче сигнала, приводящего капоптозу клетки. Благодаря механизмам обратной связи и противоапоптотическимсигналам, передающимся в геном по пути через NF-κB, возрастает вероятность обратногопереключения клетки, т.е.
ее выживания. На больших временах количество рецепторов,связанных с HTLP и TNF, уменьшается за счет деградации, что приводит ко второмупереключению поведения клетки и ее выживанию. При этом переключение возможныхформ поведения клетки – выживание или переход к апоптозу – становится цикличным.ОБСУЖДЕНИЕОчищенный полисахарид HTLP, выделенный из коркового слоя клубней Helianthustuberosus L., является проявляющим свойства полиэлектролита β-гликаном с β-(1→4) и β(1→3) гликозидными связями и с молекулярной массой 1–2 МДа. Именно эти три фактораявляются главными в определении его структурных особенностей и, как следствие,проявлениях биологических активностей.
Разнообразные β-гликаны, как правило,обладаютразличнымиструктурнымихарактеристиками,различаясьстепеньюразветвленности молекулы, молекулярным весом (MW) и конформацией (тройнаяспираль, однонитевая спираль, структура неупорядоченного клубка) [Sadahiro et al., 2007].Уже в течение долгого времени, несмотря на некоторые исключения, MWпризнаетсякритическимпараметром,определяющимбиологическуюактивностьмолекулы.
Гликаны с высоким MW обычно обладают более высокой биоактивностью [ElEnshasy et al., 2013; Paterson et al., 2014]. Для того чтобы вызвать биологический эффект,полисахарид должен первоначально провзаимодействовать с рецепторами клеточнойповерхности. Полисахариды с высоким молекулярным весом (MW) могут с большейчастотой контактировать с рецепторами и вызывать внутриклеточные сигнальныекаскады. Кроме того, крупные полисахариды обладают большим числом повторяющихсязвеньев и, следовательно, большим набором свободных биологически активных связей.19На примере HTLP также можно проследить ту же закономерность.
Адьювантнойактивностью к ЭБ обладал только высокомолекулярный пик, с MW 1–2 МДа.Следует обратить внимание и на тот факт, что молекула HTLP является заряженноймолекулой, что, безусловно, сказывается и на характере взаимодействия с рецепторами.Так, фракции HTLP после ионообменника DEAE 650 S TSK проявляли совершенноразную адъювантную активность. Фракция нейтральных полисахаридов таковойактивностью не обладала вовсе.Очищенная полисахаридная фракция, HTLP, представлена гетерополисахаридом,состоящим в основном из глюкозы, галактозы, глюкуроновой и галактуроновой кислот снебольшим количеством рамнозы, арабинозы, маннозы, что видно как из ВЭЖХ анализа,так и ЯМР, с 0,5% содержанием белка.Типгликозиднойсвязиявляетсяещеоднимважнымфакторомдляпротивоопухолевой и иммуностимулирующей активности.
В этом смысле молекулу HTLPможноназватьуникальной.Наиболееизучены(1→3)-и(1→6)-β-D-глюканы.Полисахарид HTLP, в свою очередь, характеризуется наличием как β-(1→4), так и β(1→3) связей, которые необходимы для проявления им биологической активности, чтобыло установлено с помощью ферментативной обработки. HTLP помимо глюкозысодержит много галактозы и уроновых кислот. Поэтому можно провести аналогию скаррагинанами,структурноеразнообразиекоторыхобусловленоприсутствиембиологически активных -(1→4)-остатков в виде 3,6-ангидрогалактозы.Полисахаридная субстанция HTLP проявляла антиметастатическую активность вшироком диапазоне концентраций: и в 1,5 мкг на животное, и в 100 мкг вэкспериментальной модели карциносаркомы Уокера in vivo.
Учитывая наличиеиммуномодулирующей активности у полисахарида из Helianthus tuberosus L., можноутверждать, что полисахарид обладает прямым и непрямым противоопухолевымдействием.ЕслисравниватьметастазирующейдвевыбранныекарциномылегкихэкспериментальныеЛьюисаявляетсямодели, тонаиболеемодельадекватной,приближенной к реальным событиям в организме для изучения антиметастатическойактивностиполисахарида.ПосколькукарциномаУокерапроявляетсвойстваорганотропности к легким, то развивающиеся опухолевые узлы, возможно, правильнеерассматривать как первичную опухоль, а не как истинные метастазы. На основании этогодопущения мы предполагаем, что эта разница является определяющей в объясненииантиметастатической активности HTLP.
Из литературных данных известно, что процессметастазирования включает сложный каскад процессов, включая клеточную адгезию,20миграцию, инвазию, межклеточные взаимодействия и взаимодействие клетки свнеклеточным матриксом. Адгезия между опухолевыми клетками и эндотелиальнымиклетками сосудов является одним из важнейших факторов метастазирования раковыхклеток [Wan et al., 2013].
В субпопуляции метастатических раковых клеток по сравнениюс доброкачественными или нормальными клетками высоко экспрессируется галектин-3[Iurisci et al., 2000]. Галектин-3 участвует в различных биологических процессах, такихкак межклеточные взаимодействия, пролиферация, дифференцировка, апоптоз [Liu et al.,2005; Thijssen et al., 2007]. Галектин-3 способствует прогрессии опухоли и маскированиютрансформированных от иммунокомпетентных клеток путем связывания с рецепторами Тклеток, что приводит к ингибированию активации Т-клеток и апоптозу Т-клеток[Fukumori et al., 2003].Предполагается, что одним из возможных объяснений антиметастатическойактивности HTLP является ингибирование им рецептора галектина-3. В работе Ксяоге Гао[Gao et al., 2013] описана структура молекулы галектина-3, которая имеет С-концевуюобласть, распознающую углеводы (CRD), специфически связывающуюся с бетагалактозидами и N-концевую область, обогащенную пролином и глицином, которая имеетцентр связывания линейного тетрасахарида в виде канавки [Seetharaman et al., 1998].Полученные данные по инактивации генов целевых рецепторов TLR-6, CR3 иDectin-1 макрофагов и блокировании их моноклональными антителами однозначносвидетельствуют об участии двух рецепторов – Dectin-1 и TLR-6 – в активациимакрофагальных клеток RAW 264.7 полисахаридом HTLP, поскольку при выключениигенов хотя бы одного рецептора выработка цитокина TNF-α в пределах погрешности неотличается от значений в контрольной культуре клеток.
Таким образом, для проявлениябиологической активности (активации клеток и выработки цитокинов) HTLP необходимыоба рецептора – Dectin-1 и TLR-6. В связи с этим возможно несколько способоввзаимодействия полисахаридной молекулы и клеточных рецепторов и передачивнутриклеточного сигнала.Во-первых, за счет большой молекулярной массы возможно связывание HTLPсразу с двумя рецепторами, что приводит к активации сразу двух сигнальных каскадов,которые обладают эффектом синергизма при участии транскрипционного фактора NF-κB.Активация NF-κB при связывании с Dectin-1 происходит при участии Src, Syk и CARD9MALT1-Bcl-10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
