Автореферат (1102417), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Болееподробное описание параметров и их численные значения приведены в текстедиссертации.РезультатыИз грубой вытяжки Helianthus tuberosus L. была экстрагирована полисахариднаяфракция. Дальнейшая экстракция, очистка и ультрафильтрация позволили увеличитьстепень чистоты и гомогенности фракции полисахаридов, а полученный острый пик нахроматограмме ЖХВД, последнего этапа очистки – полисахарид HTLP (рисунок 2). Пооси y – относительные единицы поглощения.Рисунок2.ВЭЖХ-ГПХвыделенияфракции полисахаридов HTLP. Детекция –по поглощению при длине волны 220 нм.На оси ординат отложены относительныеединицы поглощения, на оси абсцисс –минуты.Физико-химические характеристики HTLPСпектральные характеристики.В УФ-спектре присутствует максимум в области 190–210 нм, характерный дляполисахаридов и небольшой максимум в области 280 нм, характерный для белков(рисунок 3).11Рисунок 3.
Характерный УФ-спектр HTLP.В ИК-спектре HTLP (рисунок 4) отмечаются полосы поглощения около 1740 см–1,которые соответствуют карбоксильной группе, указывающей на присутствие уроновыхкислот в HTLP, а сильные поглощения на 1074 и 1024 см–1 и среднее поглощение на1148 см–1, при наличии колебаний пиранозного кольца, означают наличие структуры,присущей β-глюкану. Таким образом, ИК–спектр HTLP имеет характерные дляполисахаридных структур полосы поглощения.Рисунок 4. Характерный ИК-спектр для HTLP.C и 1H ЯМР-спектры позволили смоделировать предположительную структуру13полисахарида с использованием программного обеспечения CASPER и NMRgraph.Моносахаридный состав HTLP. Методом ВЭЖХ было получено, что полисахарид HTLPимеет следующий моносахаридный состав: Glc – 30%, GalA – 23%, GlcA – 15%, Gal –13%,Rha – 6%, Ara – 4%, Man – 3%, Xyl – 2%.Совместная обработка ферментами литиказой из Arthrobacter Luteus и целлюлазойиз Aspergillus niger приводила к практически полной потере биологической активностиполисахаридной фракции в модели стимуляции продукции АОК.Биологическая активность12Стимуляция антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей послесовместного введения HTLP с эритроцитами барана (ЭБ).
В эксперименте была выявленастимуляция образования антител к ЭБ в клетках селезенок мышей (таблица 1).Таблица 1. Стимуляция антителообразующих клеток в селезенках мышей послесовместного введения HTLP и 2×106 ЭБ.Образец,1101001000КонтрольАОК200 ± 16502 ± 75743 ± 80927 ± 9447 ± 6Кст*4,310,715,819,7–мкг/мышь* - отношение числа АОК в опыте к числу АОК в контролеПосле обработки HTLP ферментами литиказой и целлюлазой его адъювантнаяактивность практически полностью исчезала.
Так, например, полисахаридный гидролизатпосле обработки литиказой (100 мкг/мышь) показал стимуляцию АОК до 68 ± 7, аконтроль – 65 ± 7. После аналогичной обработки HTLP целлюлазой (100 мкг/мышь)стимуляция АОК составляла 104 ± 9 против 83 ± 9 в контроле.Оценка цитотоксического действия HTLP на клетки линии RAW 264.7.При добавлении полисахарида (200 мкг/мл) в культуру клеток процент мертвыхклеток составил 2,99 ± 0,54%, а в контроле – 2,76 ± 0,25%, что свидетельствует оботсутствии цитотоксичности у полисахарида HTLP.Определение МТТ-редуктазной активности при исследовании токсичности HTLPна клетках линии RAW 264.7.Культивирование клеток линии RAW 264.7 24 часа с 200 мкг/мл HTLP неприводило к достоверному увеличению процента мертвых или живых клеток в культурахклеток линии RAW 264.7 в модели по определению МТТ-редуктазной активности иокрашиванию культур клеток пропидий иодидом.Влияние HTLP на продукцию TNF, IL-1β, IL-6 в культуре мононуклеарных клетокчеловека (МПК).
Уровень продукции TNF мононуклеарами оказался сходным уразличных доноров после 12-часовой инкубации с HTLP. Сравнительно с контрольными иLPS-индуцированнымикультурамидобавлениеHTLPприводилокстимуляциипродукции TNF у всех доноров до 8,4 раз. Выработка IL-1 была изучена на МПК,выделенных от трех доноров, которые различались по начальному уровню продукции IL-1без добавления и с добавлением LPS. При высокой продукции IL-1 (как спонтанной, так иLPS-индуцированной) внесение полисахарида HTLP в клеточные культуры донороввлекло за собой снижение количества, высвобождаемого IL-1 (донор 1 и 3). Напротив, при13низкой продукции цитокина (донор 2) наблюдалась стимуляция высвобождения IL-1. Привоздействии полисахарида на культуры МПК доноров подавлялся высокий уровеньпродукции IL-1 и стимулировался низкий уровень LPS-индуцированной продукции IL-1.Внесение полисахарида в клеточные культуры доноров приводило к стимуляциивыработки IL-6.
Однако можно было наблюдать индивидуальные различия стимуляциипродукции IL-6 в зависимости от доз углевода. Малые концентрации полисахарида (1–3мкг/мл) у двух доноров – 2 и 3 – стимулировали выработку LPS-индуцированного IL-6.Подобная стимуляция наблюдалась после внесения в клеточную культуру МПК донора 3углевода в пределах диапазона доз 10–30 мкг/мл. Стимуляция продукции IL-6 в культурахМПК, не обработанных LPS, происходила только при добавлении к ним относительновысоких доз полисахарида (доноры 1 и 2).Индукция интерферона in vivo и in vitro. Максимальная продукция сывороточногоIFN через 6 часов после введения раствора полисахарида достигала 256 МЕ/мл, тогда какгоссипол индуцировал 8–16 МЕ/мл IFN. Таким образом, титры IFN, синтезированного умышей в ответ на введение полисахарида, в 16–32 раза превышали уровень IFN в ответ навведение стандартного индуктора интерферона госсипола.Стимуляция активности натуральных киллеров.
Индекс цитотоксичности длямодели с добавлением лимфоцитов периферической крови (ЛПК) составил 61 ± 3, а придобавлении ЛПК совместно с полисахаридом – 78 ± 3. При этом добавление толькополисахарида не приводило к сильной цитотоксичности и индекс составил 4 ± 1. Такимобразом, полисахарид усиливает активность натуральных киллеров in vitro, но при этом неявляется цитотоксическим агентом.Противовирусная активностьПолисахарид обладает ярко выраженным протективным и терапевтическим(противовирусным) действием. Выживаемость мышей составила 80% и 70% приоднократном введении HTLP за 5 дней и двукратном – за 5 дней и через 3 часа послеинфицирования 10ЛД50, а при 100ЛД50 – 57% и 63%, соответственно.
При этом в контролевыживаемость составила 17%, что меньше в 3,4 и 3,7 раза, чем в опытных группах. Придозе вируса 10ЛД50 защитный эффект HTLP колебался в интервале 53–63% в сравнении с15% у ацикловира; а при дозе 100ЛД50 – 57–63% при отсутствии эффекта у ацикловира иполном вымирании контроля.
Средняя продолжительность жизни выросла в опытныхгруппах HTLP и при 10ЛД50, и при 100ЛД50 с HTLP – почти в 3 раза.Противоопухолевая активность in vitroHTLP вызывал торможение роста опухолевых клеточных линий, при этоммаксимальное значение достигалось при 200 мкг/мл: около 81% для L-929 и 40% – Hep-2.14Такое торможение роста культуры клетоксвязано, скорее всего, с запускомпроапоптотических каскадов в трансформированных клетках, поскольку HTLP необладает прямым цитотоксическим действием, что было показано в одном изэкспериментов. Антиметастатическая активность HTLP показана в экспериментальноймодели карциносаркомы Уокера in vivo, при этом максимальное ингибирование числаопухолевых клонов составило около 37% при ежедневном введении HTLP.В экспериментальной модели карциномы легких Льюиса in vivo торможение ростаопухоли достигало 15%.
Другой важный показатель онкологического процесса –образование метастазов в легкие. Наибольшее торможение процесса метастазирования,около 40%, наблюдалось к 20-ым суткам в группе животных, получавшей 0,5 мг/кгпятикратно. В то же время данные прямого подсчета количества метастазов в легочнойткани контрольных и опытных животных позволяют установить, что однократноевведение полисахарида в дозах 25 и 5 мг/кг тормозит процесс метастазирования на 60 и75%, соответственно, по сравнению с контролем.
Отчетливый антиметастатическийэффект прослеживается и в более поздние сроки развития процесса. На 17-ые сутки ростаопухоли антиметастатический эффект наблюдается во всех группах животных.Ингибирующий эффект варьирует в зависимости от дозы в пределах 30–50%. Торможениепроцесса метастазирования к 20-ым суткам составляет 50–75%.Экспериментальная модель выживаемости гемопоэтических стволовых клетокВ модели определения количества КОЕ-С в подопытных группах образуется в 2,0–2,3 раза больше колоний спленоцитов, чем в контрольной группе. Это свидетельствует оналичии у исследуемого полисахарида способности защищать гемопоэтические стволовыеклетки от действия ионизирующего излучения.Экспериментальная модель абсолютной выживаемостиHTLP обладает радиопротекторными свойствами. Максимальная выживаемостьпри облучении в дозе 800 рад составила 95% при введении HTLP через 6 часов послеэкспозиции в дозе 100 мкг/животное, что выше контрольных значений почти в 4,8 раза, аминимальная – 65%, что выше контрольных значений почти в 3,3 раза.
Для дозы 850 радзначения составили – 40% и 0%, соответственно, в контроле – 0% (таблица 2).15Таблица 2. Результаты оценки противолучевой активности полисахарида HTLP.ВремяДоза800 радвведенияпрепарата,ЧислоВыжиломкг/мышьживотныхАбсЗа 1 час850 рад%ЧислоВыжиложивотныхАбс%12013652000,0102016802015,010020126019315,8120168020420,0102016802000,0100161487.520210,0120199520210,01019178520210,0100191684.22015,0Через 24120168020735,0часа1020168020840,010020168019631,6Через1часЧерез6часовПри этих дозах облучения выживаемость мышей в контрольных группах была равна20% и 0%, для 800 и 850 рад соответственно.Изучение рецепторного взаимодействия и молекулярных механизмов действияИнактивация генов целевых рецепторов и продукция TNF-α.
HTLP, как и LPSявляется стимулятором выработки TNF-α. В сравнении с контролем уровень выработкиувеличился в 18,3 раза в случае HTLP и в 23,2 – LPS на 4 час, а на 24 – в 7,4 и 7,3 разасоответственно (рисунок 4 и 5). По оси у – количество TNF-α в культуральной жидкости впкг/мл. Контрольные значения TNF-α в культурах с единичными выключеннымирецепторами в пределах погрешности не отличались от контроля без выключенныхрецепторов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
