Автореферат (1102417), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Все изложенные в диссертацииновые результаты получены автором лично или при его непосредственном участии вподготовке экспериментов.Апробациярезультатов.МатериалыдиссертациидокладывалисьнаIVМеждународной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системнойрегуляции физиологических функций» (г. Москва, 2015 г.) и VIII МеждународнойНаучной Конференции SCIENCE4HEALTH2017 (г.
Москва, 2017 г.).Степень достоверности и апробации результатовПо теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 7 статей, изкоторых 5 статей в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данныхWeb of Science, Scopus, RSCI, 2 тезисов и 1 монография.Структура и объем работыДиссертационная работа по структуре состоит из введения, трех глав, обсуждения,выводов и списка литературы.
Объем диссертации составляет 192 страницы текста,включая 26 рисунков и 28 таблиц. Список использованной литературы содержит 308наименований.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВведение представляет собой общую характеристику темы работы, обоснованиеактуальности, определение цели и задач диссертационного исследования, положений,выносимых на защиту, научной новизны, практической и теоретической значимости, атакже описание методологии и методов исследования.Обзор литературы состоит из четырех подразделов, описывающих углеводы и ихместо в живой природе.
В первом разделе приведена общая характеристика,классификация и строение углеводов. Во втором разделе описаны различные функции ибиологическаяактивность–иммуномодулирующая,противоопухолевая,антиоксидантная, обнаруженные к настоящему времени у полисахаридов: глюканов,гликанов, пектиновых и арабиногалактановых полисахаридов, гиалуронанов. В третьемразделе изложен современный взгляд на проблему взаимосвязи физико-химических и6структурных характеристик полисахаридных молекул с их биологической активностью.
Вчетвертомразделепредставленыхарактеристикиклеточныхрецепторов,взаимодействующих с полисахаридными молекулами или их фрагментами, в том числесемейств рецепторов: TLR, NLR, SR, LacCer, CR и CTLR, а также краткое описаниесигнальных каскадов, ассоциированных с ними.Материалы и методыДля выделения полисахаридов c молекулярной массой 1–2 МДа и их анализа былиспользован сорт Helianthus tuberosus L. Все использованные клеточные культуры былиполученывФГБУНИМБим.В.А.Энгельгардта.Лабораторныеживотные,использованные в экспериментах, были приобретены в питомнике «Андреевка» ГУ НЦбиомедицинских технологий РАМН.Полисахарид выделяли из клубней Helianthus tuberosus L.Количественное определение карбогидратов проводили фенолсернокислотнымметодом Дюбуа [Dubois, 1956].
Для измерения количества белка в составе полисахаридаиспользовался метод Лоури [Lowry, 1951].Фракциюсдиапазономмолекулярныхмассбольше300кДапослеультрафильтрации растворяли в дистиллированной воде, центрифугировали и разделялина анионообменнике DEAE 650 S TSK. Элюцию проводили водой и растворами KCl. Дляработы отбирали фракции по качественной реакции с фенолсерной кислотой. Полученныефракцииобессоливалииконцентрировалитангенциальнойультрафильтрацией,лиофильно высушивали и тестировали на наличие активности. Для разделения помолекулярным массам использовали эксклюзионную жидкостную хроматографию.Фракцию,полученнуюсиспользованиемраствора0,5МKCl,послеионообменника DEAE 650 S TSK разделяли с использованием колонки XK 50/100 сToyopearl HW-75. Оценивали молекулярную массу полисахарида с использованиемдекстранов Т-серии и голубого декстрана с молекулярной массой 1–2 МДа.Молекулярную массу и гомогенность HTLP определяли также с помощьюProminence Series HPLC system с фотодиодным детектором и колонкой TSKG6000PW.Контроль выхода полисахаридов проводили методом Дюбуа.
Фракции различных пиковобъединяли, диализовали и лиофильно высушивали. Все работы по изучениюструктурных характеристик и биологической активности проводили с фракцией,прошедшей все этапы очистки и названной HTLP.УФ-спектры поглощения HTLP регистрировали на спектрофотометре UV-1800Shimadzu. Спектры снимали в диапазоне длин волн 190–1100 нм.7Для снятия ИК-спектров использовался прибор IRAffinity-1 FTIR System с ATRMIRacle-10.
Разложение контура полос в спектре делали с использованием пакетаACDLabs/Spectrus. Спектры регистрировались в диапазоне от 4000 до 400 см-1.Для ЯМР-анализа использовался ЯМР-спектрометр Bruker Avance 400. 1 мгвещества растворяли в 0,5 мл D2O. Моделирование возможной структуры полисахаридапроводили с использованием программ CASPER и NMRgraph.Для определения моносахаридного состава проводили кислотный гидролиз.Конечные гидролизаты анализировали на хроматографе Prominence Series HPLC.Тип гликозидной связи определяли путем обработки полисахаридных растворовлитиказой из Arthrobacter Luteus, а также целлюлазой из Aspergillus niger в соответствии сметодикой Стоуна и Кларка [Stone et al., 1992]. После чего проверяли активность в моделистимуляции антителообразующих клеток (АОК).Пирогенность HTLP проверялась на здоровых кроликах обоего пола.
Раствор,содержащий полисахарид и 0,9% NaCl, вводился в ушную вену.Стимуляцию АОК клеток исследовали на мышах F1(СВАхС57Вl/6). В качествеантигена для иммунизации применяли дефибринированные эритроциты барана (ЭБ). ЭБвводили внутрибрюшинно. Уровень иммунного ответа у мышей, иммунизированных ЭБ,определяли по количеству АОК, выявляемых в селезенке методом Ерне [Jerne et al, 1963].Оценка цитотоксичности HTLP проводилась на линии клеток RAW 264.7. Оценкажизнеспособности клеток проводилось через 24 часа после добавления HTLP путемокрашивания культур клеток пропидий иодидом и бис-бензимидом с целью обнаруженияядер погибших клеток и общего количества клеток в культуре соответственно.Визуализация окрашивания проводилась с помощью инвертированного.Оценку токсичности HTLP проводили спектрофотометрически после редукции(3,4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) бромида в формазановыйпигмент под влиянием внутриклеточных дегидрогеназ.Влияние HTLP на количество клеток линии RAW 264.7 оценивали через 4 и 24 часаинкубирования макрофагов с HTLP.
Осуществляли подсчет клеток с помощью ручногоавтоматического цитометра Septer.Иммуномодулирующую активность проверяли в нескольких экспериментах –модулировании уровней цитокинов IL-1, IL-6, TNF, IFN. Активность TNF в надосадочныхжидкостях определяли методом Рафф и Гилфорд [Ruff et al., 1981] на клетках L-929.Контролем служили клетки, инкубированные с LPS.
Вторым способом оценки влиянияполисахарида на выработку фактора некроза опухолей было определение экспрессии8геновTNF-αнамакрофагальнойклеточнойлинииRAW264.7методомиммуноферментного анализа с помощью набора Mouse TNF alpha Elisa Ready-SET-Go!.Для инактивации генов целевых рецепторов методом РНК-интерференции былииспользованысинтезированныеолигонуклеотидныепоследовательности,комплементарные фрагментам целевых рецепторов – Dectin-1, TLR-6, CR3. Дляполучения рекомбинантного лентивируса использовали клетки HEK293T, которыекотрансфецировалисьплазмидамиpRSV-Rev,pMDLg/pRRE(ген/вставкаHIV-1GAG/POL), pCerulean-VSVG и плазмидой, несущей shRNA гена интереса.
Проводилизаражение и селекцию клеток RAW 264.7. Проверка выключения рецепторов велась посвечению метки в генном конструкте RFP, GFP и BFP.Блокировка целевых рецепторов проводилась антителами с концентрациями: CR3,TLR-6 и Dectin-1. В дальнейшем клетки активировали LPS и HTLP и тестироваливыработку TNF-α с использованием 96-луночного планшетного ридера.Дляоценкипротивовируснойактивностиполисахаридаиспользовалиэкспериментальную модель герпетического менингоэнцефалита мышей. ИспользовалиВПГ-1 штамм Клейман. Титр вируса определяли на модели фибробластов эмбрионов кури культуре клеток Vero. Белых мышей BALB/c инфицировали вирусом Клейманавнутрибрюшинно. Pефеpенц-пpепаpатом был выбран ацикловир. Раствор полисахаридавводили мышам в хвостовую вену.Для изучения противораковой активности in vitro использовали линии клетоккарциносаркомы гортани человека Hep-2 и мышиной анеуплоидной фибросаркомы L-929.Противораковую активность оценивали подсчетом видимых раковых клеток, окрашенныхтрипановым синим, в сравнении с контрольными культурами.
Исследование in vivoактивности противораковых свойств полисахарида из Helianthus tuberosus L. ивоздействия на метастазы проводили на карциносаркоме Уокера. Использовались самцы исамки крыс породы «Август». Антиметастатическую активность HTLP изучали наэкспериментальной модели карциномы легких Льюиса.Для оценки радиопротекторной активности фракции полисахарида использовалиэкспериментальные модели абсолютной выживаемости и выживаемости гемопоэтическихстволовых клеток.Принципиальнаясхемамоделипередачивнутриклеточногосигналаприсвязывании полисахарида с рецепторами и формированием петли обратной связи сучастием TNF и TNFR1 представлена на рисунке 1.В нормальном состоянии клетки уровень проапоптотического сигнала низок,вероятность перехода в предапоптотическое состояние мала, и клетка выживает, несмотря9на присутствие HTLP.
В трансформированной клетке ситуация другая. При воздействииHTLP проапоптотический сигнал может превысить некий пороговый уровень, ипроисходит бифуркация: состояние клетки становится неустойчивым, и с большойвероятностью она может перейти не только в предапоптотическое состояние, но и капоптозу. В связи с этим представляется возможным описание такого бифуркационногоповедения клетки с помощью всего двух переменных, выбранных специальным образом.Рисунок 1.
Принципиальная схема формирования регуляторных сигналов в клеткепри взаимодействии HTLP с рецепторами Dectin-1 и TLR-6.Все реакции в регуляторных путях происходят самопроизвольно (имеются в виду неэлементарные, а суммарные реакции, связанные с переносом сигнала между узламирегуляторной сети.), т.е. с понижением энергии Гиббса системы, поэтому клетку можнорассматривать как активную среду. В качестве обобщенной координаты x будемиспользовать некую условную функцию состояния графа реакций в регуляторной сети,такую, что для реакций на клеточной мембране она равна нулю, а в «геноме» – единице.Две переменные, описывающие поведение клетки, зависят от координаты и времени исоответствуют вероятностям формирования сигналов для выбора проапоптотического илипротивоапоптотического пути. Поскольку узлов в графе реакций много, перенос сигналапо обобщенной координате можно описать как диффузию [246].
В дальнейшем поддиффузией понимается именно такой перенос сигнала.Для описания поведения клетки предлагается использовать модифицированнуюсистему уравнений ФитцХью-Нагумо [247]:∂u∂2 uε2 ∂t -ε2 Du ∂x2 = -u(u-α)(u-1) + γuv ,2 − 2 2 = − + (),10сходнуюсиспользованнойранеепримоделированииструктурообразованиявурбоэкосистемах [248]. Система решается численно, при этом на границах областирасчета задаются краевые условия Неймана.Безразмерные переменные u и v соответствуют вероятностям формирования про(«активатор») и противоапоптотического («ингибитор») сигнала (можно говорить и обинтенсивностях соответствующих сигналов). Параметры Du и Dv – безразмерныекоэффициенты диффузии, (t) > 0 – кинетический параметр взаимодействия активатора иингибитора, – параметр активации системы, – кинетический параметр затуханияпротивоапоптотического сигнала, – кинетический параметр, позволяющий учестьразличие в скоростях распространения про- и противоапоптотического сигнала.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
