Автореферат (1102417)
Текст из файла
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕНАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А.ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУКНа правах рукописиГЕНЕРАЛОВ ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧБИОФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕС РЕЦЕПТОРАМИ DECTIN-1 И TLR-6 ПРИРОДНЫХПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ HELIANTHUS TUBEROSUS L.Специальность 03.01.02 – биофизика, 03.01.08 – биоинженерияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква - 2017Работа выполнена в лаборатории пролиферации клеток Федеральногогосударственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им.В.А.
Энгельгардта Российской академии наук, г. Москва.Научный руководитель:Чумаков Петр Михайловичдоктор биологических наук, профессор, заведующийЛабораторией пролиферации клеток ИМБ РАННаучный руководительЯковенко Леонид Владимировичдоктор физико-математических наук, профессор кафедрыбиофизики физического факультета МГУ имени М.В.ЛомоносоваОфициальные оппоненты:Пантелеев Михаил Александровичдоктор физико-математических наук, заведующийЛабораторией молекулярных механизмов гемостазаЦТПФХФ РАНКлечковская Вера Всеволодовнадоктор физико-математических наук, профессор, заведующаяЛабораторией электронографии ИК РАНБыстров Владимир Сергеевичдоктор физико-математических наук, ведущий научныйсотрудник, руководитель Группы компьютерногомоделирования молекулярных наноструктур и биосистемИМПБ РАН - филиала ИПМ им.
М.В. Келдыша РАНЗащита диссертации состоится «16» ноября 2017 г. в 17-00 часов на заседаниидиссертационного совета МГУ.01.04 Московского государственного университета имениМ.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, Дом 1, строение 2,Физический Факультет.E-mail: info@physics.msu.ruС диссертацией можно ознакомиться в отделе диссертаций научной библиотекиМГУ им. М.В. Ломоносова (Ломоносовский просп., д.
27) и на сайте ИАС «ИСТИНА»:https://istina.msu.ru/dissertation_councils/councils/28357490/Автореферат разослан «___» __________ 2017 г.Ученый секретарьдиссертационного совета,кандидат технических наукА. Э. Сидорова1ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы и степень ее разработанностиГликаны являются универсальным и необходимым компонентами жизни. Ониимеют размеры от одного моносахарида до полисахаридов длиной в тысячу единиц иобнаруживаются в больших структурных полисахаридах, секретируемых компонентахслизи или в составе белковых и липидных конъюгатов [Ju et al., 2001; Wennekes et al.,2009; Somerville, 2006]. Сахара покрывают клетки каждого организма и представляютсобой широкий класс органических молекул на Земле [Weinbaum et al., 2007].
Структурымоносахаридов впервые установлены Фишером в середине 1880-х годов [Fischer et al.,1909], но прошло почти столетие, прежде чем ученые начали понимать сложные функцииэтих молекул в биологии [Bertozzi et al., 2001]. Отставание в понимании структуры ифункции гликанов связано со сложностью, присущей регуляции и сборке этихбиомолекул. Гликаны непосредственно не кодируются геномом и, таким образом, ихбиосинтез и структура диктуются метаболизмом, передачей сигналов и метаболическимстатусом клетки [Dennis et al., 2009; Parker et al., 2010].
Кроме того, для них характернаконформационная изомерия [Cummings, 2009; Muthana et al., 2012].В настоящее время человечество всё чаще сталкивается со следующим рядомпроблем: снижение иммунного статуса человека, рост числа заболеваний вируснойэтиологии и онкологических заболеваний и появление новых типов вирусов изаболеваний, возникновение у патологических микроорганизмов толерантности кантибактериальным препаратам, рост радиационного фона, загрязнение окружающейсреды и многое другое. В связи с этим все более актуальными становятся меры защитыорганизма от лучевых поражений и восстановления клеточного баланса различныхорганов и тканей, для чего необходимо создание нетоксичных радиозащитных ирегенерационных препаратов.
Перспективным подходом в этом направлении являетсяпоиск полисахаридов, обладающих необходимой активностью.В настоящее время хорошо известно, что гликаны играют важную роль в самыхразнообразных биологических событиях, включая клеточную адгезию и миграцию,развитие организма, прогрессирование заболевания и модуляцию иммунологическихреакций [van Kooyk et al., 2008; Ohtsubo et al., 2006].В последние годы исследования подтвердили, что полисахариды из натуральныхпродуктов обладают разнообразными полезными терапевтическими эффектами испособствуют укреплению здоровья людей. В частности, морские водоросли, иполученные из них полисахариды, такие как альгинат, фукоидан, каррагинан, ламинаран иагар [Laurienzo et al., 2012], широко применяются для биомедицинских и биологических2целей [Venkatesan et al., 2015; Valente et al., 2012; Silva et al., 2012; Popa et al., 2014],например, для тканевой инженерии, доставки лекарств, заживления ран и созданиябиосенсоров.Одним из источников углеводов, разнообразных по структуре и обладающихшироким спектром биологических активностей, является Helianthus tuberosus L.
Изучениефизико-химических свойств, биологических активностей и молекулярных механизмовдействия этих полисахаридов, а также освоение способов их применения на практикеможет дать возможность создавать новые лекарственные средства.До последнего времени полисахариды из Helianthus tuberosus L. их структурнофункциональныехарактеристики,атакжерецепторы,взаимодействующиесполисахаридами, были слабо изучены.
В ходе данной работы был выделен иохарактеризован новый биологически активный полисахарид из Helianthus tuberosus L.Для изучения взаимодействия с клеточными рецепторами полисахаридов из Helianthustuberosus L. использовался современный подход в гликохимии – выключение генов.ПолисахаридыизHelianthusпротивоопухолевым,tuberosusрадиопротекторнымL.обладаютдействиемииммуномодулирующим,являютсянетоксичнымиприродными биополимерами, что может обеспечить их широкое применение в такихобластях, как фармакология, ветеринария и медицина.Цель диссертационной работыЦельюисследованияявляетсяопределениемолекулярныхмеханизмовбиологической активности природных полисахаридов из Helianthus tuberosus L.Задачи диссертационной работыВыделение и очистка полисахарида из Helianthus tuberosus L. (HTLP) методамигельпроникающей хроматографии, ультра- и тангенциальной фильтрации.Определение физико-химических характеристик полученного полисахарида, такихкак тип гликозидной связи, спектральные характеристики (инфракрасный спектр,ультрафиолетовый спектр, ЯМР-спектр), моносахаридный состав, молекулярная масса.Изучениебиологическойактивностивыделенногополисахаридавпротивовирусной, противораковой, иммуномодулирующей и радиопротекторной моделях.Отработка подходов для изучения рецепторного взаимодействия и определениевозможных молекулярных механизмов действия полисахарида из Helianthus tuberosus L.Построение биофизической модели для описания переключения состояния клеткипри взаимодействии полисахарида с рецепторами Dectin-1 и TLR-6 с точки зрениябифуркационного подхода.3Основные положения, выносимые на защиту1 Полисахарид из Helianthus tuberosus L.
обладает биологической активностью, котораяпроявляется в моделях: противораковой, радиозащитной, колониестимулирующей,противовирусной и иммуномодулирующей.2. Полисахарид из Helianthus tuberosus L. обладает разветвленным строением, с боковымицепями с β-(1→4) и β-(1→3)-гликозидными связями, которые определяют биологическуюактивность; относится к классу гетерогликанов и содержит 0,5% белка.3. Биологическое действие полисахарида обусловлено взаимодействием HTLP срецепторами Dectin-1, TLR-6 и активации их внутриклеточных каскадов.4. В результате применения полисахарида из Helianthus tuberosus L. происходит запускиммунологических процессов на клеточном и организменном уровнях.5.Предложеннаямодельбифуркационныхпереключенийв клетке,вызванныхвзаимодействиями полисахарида из Helianthus tuberosus L.
с рецепторами Dectin-1 и TLR6, может быть использована в качестве основы для интерпретации экспериментальныхданных.Научная новизна диссертационной работыВпервые получен биологически активный высокоочищенный полисахарид изHelianthus tuberosus L. на основе глюкозы, галактозы и уроновых кислот. Установлено,что его биологическое действие зависит от наличия β-глюкановой части в составегетерополисахарида.Впервые определены биофизические характеристики HTLP:в ИК-спектре присутствуют характерные для полисахаридов полосы поглощения;полоса в области 1148 cм–1 и характерны для β-гликанов;в УФ-спектре присутствует пик поглощения в области 280 нм, характерный длябелков.
Определение количества белка методом Лоури показало содержание до 0,5%белка, что было подтверждено и другими методами исследования;полисахарид имеет молекулярную массу 1–2 МДа со следующим моносахариднымсоставом: Glc – 30%, GalA – 23%, GlcA – 15%, Gal – 13%, Rha – 6%, Ara – 4%, Man – 3%,Xyl – 2%;по данным ЯМР-анализа структура HTLP сильно разветвлена и характеризуетсяналичием вставок экспонированных наружу β-глюканов, обеспечивающих связывание срецепторами, а также β-(1→3), так и β-(1→4) связей, критичных для проявлениябиологических активностей.В результате исследований биологической активности установлено:4полисахаридявляетсянетоксичныминеаллергеннымпротектором,интерферониндуцирующим агентом, способен стимулировать выработку TNF-α и IL-6, атакже регулировать уровень IL-1;при внутривенном введении полисахарида выживаемость подопытных мышей прилетальном кратковременном лучевом воздействии в 800 рад составляла до 95%;полисахарид является колониестимулирующим веществом, что установлено в тестена колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕ-C) – колониеобразование спленоцитовво всех подопытных группах выросло в 2,0–2,3 раза по сравнению с контрольной группой;применение полисахарида в модели герпетического менингоэнцефалита у мышейприводило к выраженному профилактическому или терапевтическому действию как всравнении c контролем, так и в сравнении c фармакопейным препаратом – ацикловиром.При дозе вируса 10ЛД50 защитный эффект составлял 50–60%, а c ацикловиром – 15%; апри дозе 100ЛД50 – 57–63% при отсутствии эффекта у ацикловира;обнаружено влияние HTLP на NK клетки в виде стимуляции и увеличенияцитотоксического индекса на 15% по сравнению с контролем;установлено, что полисахарид проявлял свои противоопухолевые свойства и вантиметастатической модели, и в модели торможения роста опухоли.В экспериментах по инактивации целевых рецепторов показано, что полисахаридактивирует клетки опосредованно, через взаимодействие с рецепторами Dectin-1, TLR-6.Установлено, что оба рецептора необходимы для активации клеток с помощьюHTLP, что подтверждается экспериментальными данными двух моделей: блокировкирецепторов антителами и инактивации генов целевых рецепторов.Моделирование показало возможность возникновения в трансформированнойклетке бифуркационого состояния выбора между апоптозом и пролиферацией, котороеобусловлено взаимодействием полисахарида с рецепторами клетки Dectin-1 и TLR-6.Теоретическая и практическая значимостьРезультатыисследованийпозволяютвключитьбиологическиактивныйполисахарид из Helianthus tuberosus L.
в группу уже охарактеризованных полисахаридов,выделенных из различных источников. Разработана методика получения из растительногосырьяполисахаридногопрепаратаспротивометастатической,противовирусной,радиопротекторной, колониестимулирующей и иммуномодулирующей активностями.Модель бифуркационого изменения состояния трансформированной клетки иполученные новые данные о полисахаридах из Helianthus tuberosus L. могут быть5использованы для создания и тестирования in silico на их основе новых лечебных ипрофилактических препаратов для медицины и ветеринарии.Личный вклад автора состоял в планировании и проведении экспериментов, атакже в анализе полученных данных, выборе и формулировании темы диссертационногоисследования, подготовке публикаций и выступлений.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
