Методы диагностики при паразитарных заболеваниях

Раздел IV

Методы  диагностики   при  паразитарных заболеваниях

Диагностика кишечных протозойных инвазий

В кишечнике человека обитает около 15 видов одноклеточных животных (Protista). Некоторые из них патогенны.

 Сбор материала. Материал для исследования :фекалии, дуоденальное содержимое, гной, мокроту собирают в чистую, обязательно сухую посуду. Перед сбором фекалий больным с оформленным калом могут назначаться солевые слабительные - сернокислый натрий или магнезия. Этим ускоряется выделение вегетативных форм простейших из верхних отделов толстой кишки.

В жидком и полуоформленном кале, как патологическом, так и после дачи слабительных, обнаруживаются вегетативные формы простейших, нередко совместно с большим или меньшим количеством цист. Во всех других жидких выделениях обнаруживаются только вегетативные формы. Ввиду быстрой гибели вегетативных форм большинства простейших во внешней среде исследование жидких фекалий должно проводиться немедленно (не позднее одного часа) после их выделения. В плотном оформленном стуле содержатся только цисты. Цисты более устойчивы, чем вегетативные формы. Поэтому оформленный кал можно исследовать и в более поздние сроки (в течение суток). Цисты образуют все простейшие кишечника, за исключением трихомонад, диэнтамебы и амебы ротовой полости. Балантидий в кишечнике человека цисты образует редко и в небольшом количестве.

Приготовление и микроскопирование мазков. Во всех случаях обследований на зараженность простейшими кишечника обязательным является приготовление и изучение нативных мазков и препаратов, окрашенных раствором Люголя. Для этого на предметное стекло на расстоянии 2-4 см друг от друга разными пипетками наносится по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора и раствора Люголя. Деревянной палочкой (одной и той же) готовят гомогенную полупрозрачную взвесь исследуемого материала сначала в капле изотонического раствора, а затем в растворе Люголя. Каждую каплю накрывают чистым покровным стеклом. При наличии в испражнениях патологических примесей (слизь, кровь) их исследуют в мазке с изотоническим раствором. Жидкий прозрачный материал (водянистые испражнения, дуоденальное содержимое) можно исследовать без изотонического раствора, нанося 2 - 3 капли его на предметное стекло и покрыв их покровным стеклом. При исследовании плотного, оформленного кала, в котором могут содержаться только цисты простейших, микроскопируются лишь препараты, окрашенные раствором Люголя. Просматривается вся площадь мазков сначала под малым (8 Х10), а затем под более сильным увеличением (10 Х 60). В каждом случае нужно промикроскопировать 2 - 3 препарата из разных мест имеющейся пробы. При сомнительных и отрицательных результатах для окончательного заключения требуется произвести не менее 3 анализов на протяжении 1 - 2 недель.

Методы консервации. Если исследование в день взятия материала невозможно (главным образом при массовых обследованиях), можно применять консерванты по Сафаралиеву или Берроузу.

1)Состав консерванта Сафаралиева: метиленовый синий - 0,2 г, 2% раствор сернокислого цинка - 82,5 мл, формалин концентрированный - 10 мл, уксусная кислота крепкая - 5 мл, фенол кристаллический - 2,5 г. Реактивы смешивают в указанном порядке. Фенол предварительно расплавляют на водяной бане. Консервант разливается во флакончики до половины их объема. Подлежащий исследованию материал от каждого больного немедленно эмульгируется отдельной деревянной палочкой в отдельном флакончике в количестве, составляющем примерно 1/3 объема консерванта. Простейшие окрашиваются уже через 5 - 10 мин и при необходимости могут сохраняться в течение нескольких месяцев. Для исследования каплю осадка со дна пробирки с помощью пипетки помещают на предметное стекло и покрывают покровным. Микроскопируют при увеличении 10Х60 или 10Х40. Иммерсионную систему используют в случае необходимости изучить объект более детально. Консервировать можно как оформленный кал, так и жидкие патологические субстраты. В смеси длительно сохраняются и хорошо окрашиваются не только цисты, но и вегетативные формы амеб и других простейших.

Рекомендуемые материалы

2)Консервант Берроуза имеет следующий состав: хлорид натрия - 0,7 г, формалин концентрированный - 5,0 мл, спирт этиловый 96о - 12,5 мл, фенол кристаллический - 2,0 г, вода дистиллированная - до 100 мл. Консервирование в нем производится таким же образом, как и в растворе Сафаралиева. Простейшие сохраняются в этом консерванте не дольше одного месяца. Для микроскопического исследования каплю осадка эмульгируют на предметном стекле в капле красящего раствора и покрывают покровным стеклом.В качестве красящего раствора используется 0,01% раствор тионина, азура или метиленового синего.

 Метод обогащения. При скудном содержании простейших в кале они могут быть не обнаружены при микроскопировании нативных мазков и мазков с раствором Люголя. В этих случаях рекомендуется применить формалин-эфирное обогащение. Для этого кусочек кала величиной с горошину тщательно эмульгируют деревянной палочкой в центрифужной пробирке в 6 мл 10% раствора формалина на изотоническом растворе. В пробирку добавляют 2 мл эфира, закрывают резиновой пробкой, энергично встряхивают в течение 1 мин, а затем центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин или 1 мин при 2500 об/мин. После центрифугирования эмульсия разделяется на четыре слоя: окрашенный в желтый цвет верхний эфирный слой, слой фекалий (фекальная пробка), затем слой формалина и под ним осадок, в котором содержатся цисты простейших. Деревянной палочкой (отдельной для каждой пробы) слой фекалий отделяют от стенок пробирки и все содержимое ее, за исключением осадка, сливают. Наклонив пробирку отверстием книзу, быстро протирают ее стенки ватным или марлевым тампоном, стараясь удалить возможно большее количество жидкости, но не затрагивая осадок. Переворачивают пробирку отверстием вверх, переносят отдельной пипеткой осадок на предметное стекло, эмульгируют его в капле раствора Люголя и исследуют по обычной методике. В случае необходимости приготовленную эмульсию можно хранить в закрытой резиновой пробкой пробирке до 2 сут.

 В процессе приготовления центрифугата даже некоторые цисты простейших частично подвергаются деструкции. Вегетативные же их формы при этом совершенно разрушаются. Поэтому указанный метод непригоден для обнаружения трихомонад и диэнтамеб, которые не образуют цист, а также для исследования жидкого стула, в котором цисты отсутствуют.

 Метод приготовления постоянных препаратов, окрашенных по Гейденгайну. Иногда в нативных мазках или в мазках с раствором йода точно определить вид простейшего не удается. Постоянные препараты, окрашенные по Гейденгайну, благодаря выявлению тонких структурных особенностей, позволяют распознавать простейших как по вегетативным формам, так и по цистам.   Для изготовления препаратов пригоден материал любой консистенции. Обычно готовят не менее двух препаратов.  Фиксация:

- Концом деревянной палочки исследуемый кал тонким слоем быстро наносится на предметное или покровное стекло (следить, чтобы материал не подсох). Мазок погружают в фиксирующую жидкость Шаудина, налитую в чашку Петри. Жидкость состоит из 2 частей насыщенного раствора сулемы (8,5: 100; растворять при нагревании) и одной части 96о спирта-ректификата, к которым добавляется ледяная уксусная кислота (3-5% к общему объему жидкости). Мазки фиксируются 15 - 20 минут.

- Мазки переносятся в 70 о спирт на 5 мин.

- Для окончательного удаления сулемы препараты помещаются на 5 - 10 минут в спирт-йод (в 70о спирт добавляется несколько капель настойки йода до светло-коричневого цвета ). Для удаления иода препараты выдерживаются в 70о спирте 5 мин. Если окраска не может быть произведена сразу, то их можно сохранять в спирте несколько дней. Протрава и окраска:

- Перед окраской - промывка дистиллированной водой - 3 мин.

- Протрава в 2 - 3% водном растворе железо-аммиачных квасцов в течение 4-20 часов (в зависимости от температуры).Кристаллы квасцов должны быть слабо фиолетового цвета; желтые не пригодны.

- Быстрое (1-3 сек.) споласкивание в дистиллированной воде.

- Перенос для окраски в 0,5% раствор гематоксилина. Для его приготовления 1,0 г кристаллическюго гематоксилина растворяют в 10 см3 96о спирта, добавляют 90 см3 дистиллированной воды и выдерживают 10 - 20 дней. За 4-24 часа перед употреблением разводят наполовину дистиллированной водой.

- Промывка перекрашенного препарата водой в течение 10 - 20 мин.

Дифференцирование:

- Для извлечения избытка краски препарат помещают в 0,5 - 1% раствор железо-аммиачных квасцов и следят за обесцвечиванием до появления серо-лилового фоа окраски препарата. На этом дифференцировку заканчивают, не доводя обесцвечивание до коричневого и желтого фона, что указывает на излишнее удаление краски, вследствие чего препараты становятся негоднmыми. Промывка в водопроводной воде (лучше проточной) 2О - 40 мин.

Обезвоживание, просветление и заделка препарата:

- Помещение препарата последовательно в 70о, 85 о и 96 о спирты, на 2 - 3 мин в каждый.

- Перенос в карбол-ксилол (25 грамм кристаллической карболовой кислоты растворить в 75 куб. см. ксилола) на 2 мин.

- Выдержать в чистом ксилоле 1 мин.

- На препарат поместить каплю канадского бальзама и накрыть покровным стеклом. Если при заделке в канадский бальзам появляется муть, значит обезвоживание было недостаточно и его надо повторить, заменив карбол-ксилол свежим.

Постоянные препараты, изготовленные таким методом, сохраняются без изменений годами. Он позволяет проводить совершенно точную диагностику простейших и дифференцйровать их от различных псевдопротозойных образований, часто наблюдаемых в кале, которые при недостаточном опыте могут быть приняты за вегетативные формы или цисты простейших.

Метод культивирования. Рекомендуются следующие среды, наиболее простые по составу и дающие удовлетворительные результаты для культивирования дизентерийных амеб и других простейших кишечника (за исключением лямблий):

- Простая сывороточная среда - смесь из 9 частей стерильного изотонического раствора (0,85%) и 1 части нормальной лошадиной (или бычьей) сыворотки, разлитая в пробирки по 8-10

 мл.

- Двухфазная сывороточная среда - на 19 частей бычьей сыворотки добавляют 1 часть мясопептонного бульона с 2% раствором глюкозы. Можно использовать также сыворотки других животных и остатки сывороток человека, поступающих в лабораторию для диагностических исследований. Смесь свертывают при 80оС в течение 2 ч в косом положении, охлаждают, а затем заливают стерильным изотоническим раствором так, чтобы он перекрывал на 1 см верхний край скоса.

- Среда Павловой - хлорида натрия 8,5 г, двузамещенного фосфорно-кислого натрия 0,59 г, однозамещенного фосфорно-кислого калия 0,45 г, дистиллированной воды 1000 мл. После стерилизации в автоклаве (30 мин при давлении 1,5 атмосферы) и охлаждения в раствор добавляют стерильную лошадиную (или бычью) сыворотку в соотношении 1:20 и разливают среду в стерильные пробирки по 5 - 7 мл.

- Среда Райса представляет собой смесь 1 части мясопептонного бульона с 4 частями изотонического раствора, к которой добавляется нативная лошадиная или бычья сыворотки в соотношении 1:10. Среду стерильно разливают в пробирки по 8 - 10 мл.

Могут быть использованы и другие, более сложные по составу среды. Для получения первичных культур простейших в пробирки со средой, предварительно проверенные на стерильность выдерживанием в термостате при температуре 37оС в течение суток (или при комнатной температуре 3 сут.), вносится комочек оформленного кала величиной с горошину или 2 - 3 капли жидкого материала. Смесь гомогенизируют встряхиванием. Засевать одновременно нужно несколько пробирок (2 - 3). Перед посевом пробирки со средами подогревают до температуры 37 о С и в каждую добавляют 1 - 2 петли рисового крахмала. Его предварительно стерилизуют сухим жаром при температуре 90 оС по 1 часу 4 дня подряд в пробирках, закрытых ватными пробками. Оптимальной температурой для культивирования является 37 оС. Результаты проверяются через каждые 24 ч в течение 5 сут. Для проверки со дна пробирки с помощью пипетки забирают каплю осадка с небольшим количеством жидкости, помещают на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Микрометрия. Размеры простейших и их ядер имеют важное значение для определения вида. Измерение производится при помощи окулярного микрометра представляющего собой линейку длиной 5 мм или 1 см с делениями, соответствующими 0,1 мм. Линейка нанесена на стекло, вмонтированное или вставляемое временно в окуляр микроскопа. Значение делений окулярного микрометра по отношению к измеряемым объектам для разных систем микроскопов и разных объективов предварительно определяется при помощи объектмикрометра. Он представляет собой линейку с делениями в 0,01 мм (10 мкм) на предметном стекле. Объектмикрометр помещают под объектив микроскопа и совмещают его линейку с линейкой окулярного микрометра. Устанавливают, какое число делений окулярного микрометра точно совпадает с определенным числом делений объектмикрометра. По этим данным вычисляют значение одного деления окулярной линейки в микронах или микрометрический коэффициент. Например, 10 делений окулярного микрометра соответствуют 2 делениям объектмикрометра. Тогда значение одного деления (микрометрический коэффициент) составит (2Х10)/10=2мкм. Вычисление микрометрического коэффициента производят с точностью до десятых или (реже) сотых долей микрона. Для измерения какого-либо микроскопического объекта следует заменить обычный окуляр на микрометрический (или вставить в него микрометрическую линейку), определить в делениях последнего длину и ширину объекта (клетки простейшего, ее ядра) и, перемножив число делений на микрометрический коэффициент, найти размеры объекта в микронах. Точно так же измеряются другие объекты: яйца и личинки паразитических червей, псевдопротозойные образования и др.

Лабораторная диагностика гельминтозов

Техника микроскопии яиц и личинок гельминтов

Просмотр препарата при гельминтоовоскопии или выявлении личинок следует начинать при малом увеличении микроскопа (объектив 8х или 10х). Обнаруженные яйца или личинки гельминтов в случае необходимости рассматриваются под большим увеличением. Препарат просматривается полностью; поля зрения последовательно чередуются по горизонтали или в вертикальном направлении. Поле зрения не должно быть слишком ярким, так как на ярко освещенном фоне плохо заметны яйца с тонкой бесцветной и прозрачной оболочкой (яйца остриц, карликового цепня, анкилостомид, кошачьей двуустки и некоторых других гельминтов).

 Гельминтоовоскопия

Исследование кала. Простые методы и методы обогащения. Метод мазка. Деревянной палочкой или спичкой из разных мест доставленной пробы берут комочек кала величиной со спичечную головку и тщательно растирают его на предметном стекле с несколькими каплями 50% раствора глицерина до получения полупрозрачного и равномерного мазка, который занимает почти всю поверхность предметного стекла. Грубые кусочки непереваренной клетчатки удаляют. Обычно мазки просматриваются при малом увеличении микроскопа (7х8) без покровного стекла. Лишь начинающему лаборанту рекомендуется покрывать мазок покровными стеклами, чтобы не запачкать объектив. При необходимости рассмотреть найденное яйцо более детально используют объектив 40х. В правильно приготовленном нативном мазке яйца глистов обычно хорошо видны под малым увеличением микроскопа. Однако их количество во многих случаях не столь значительно, чтобы они содержались в каждом мазке. Просматривать же много мазков из кала каждого обследуемого не представляется возможным, ибо резко возрастает объем работы и снижается ее эффективность. Поэтому разработаны различные методы для того, чтобы повысить концентрацию яиц в исследуемых препаратах. Некоторые из них приводятся ниже.

Метод "толстого" мазка (по Като). Комочек фекалий величиной с горошину наносят на предметное стекло, покрывают специально обработанным влажным целлофаном, прижав его резиновой пробкой к стеклу, что позволяет равномерно распределить фекалии под пленкой.

Предварительная подготовка целлофана: тонкий гидрофильный целлофан нарезают полосками 20 х 40 мм и погружают на сутки в смесь следующего состава: 3% раствор малахитового зеленого -6 мл, глицерин - 500 мл, 6% раствор фенола- 500 мл (в виде исключения можно использовать 50% раствор глицерина без добавления малахитового зеленого и фенола). 100 мл смеси достаточно для обработки 5000 пленок. Целлофановые пленки можно сохранять в такой смеси в закрытой посуде при комнатной температуре неограниченно долго.

Мазок становится пригодным для микроскопирования через 40-60 мин после приготовления.

Метод Калантарян. Основан на том, что яйца гельминтов всплывают в насыщенном растворе соли (флотационный раствор), имеющем большую чем они относительную плотность. Образовавшуюся поверхностную пленку исследуют под микроскопом. Насыщенный раствор нитрата натрия готовят путем смешивания равных объемов соли и воды с последующим кипячением до образования пленки с металлическим оттенком на поверхности. После остывания раствор готов к использованию. Относительная плотность его - 1,4. В растворе всплывают яйца всех гельминтов. Вместо нитрата натрия допустимо использование нитрата аммония. Этот метод намного превосходит по эффективности метод Фюллеборна (флотация яиц в насыщенном растворе поваренной соли) и является одним из наиболее эффективных методов обогащения (флотации).

   Для исследования по методу Калантарян комочек фекалий массой 5-10 г вначале тщательно размешивается в небольшом количестве приготовленного раствора, который затем постепенно доливается до тех пор, пока соотношение фекалий и раствора не станет равным 1:10 - 1:20. Размешивание удобнее всего производить деревянным шпателем, который после однократного использования сжигается. После размешивания всплывшие крупные частицы удаляются. К поверхности раствора прикладывается обезжиренное предметное стекло, концы которого лежат на краях стаканчика. Сосуд оставляется на 20-30 мин для отстаивания. По истечении указанного времени стекло с приставшими к нему частицами и жидкостью снимается, переворачивается нижней стороной кверху, помещается на предметное стекло больших размеров (для предохранения от загрязнения столика микроскопа) и микроскопируется. Просматривается вся площадь пленки, прилипшей к поверхности стекла. Во избежание высыхания на препарат можно нанести 2-3 капли 50% раствора глицерина и эмульгировать в нем содержимое пленки.

   При другом варианте исследования стаканчик со взвесью фекалий оставляется для отстаивания не накрытый предметным стеклом. Поверхностную пленку снимают гельминтологической петлей, несколько раз прикасаясь к ней и перенося взятые фрагменты на два предметных стекла, а затем микроскопируют как обычно.

Метод Красильникова. Сущность его заключается в том,что яица гельминтов в фекалиях под действием детергентов в период отстаивания взвеси концентрируются в осадке.

Рабочий раствор моющего средства (детергента) готовится из стирального порошка, предварительно высушенного в сушильном шкафу при 100о С в течение 1-2 ч. Для приготовления раствора каждый раз подбирается такая максимальная навеска порошка, которая растворяется без осадка. Порция фекалий величиной с лесной орех помещается в фарфоровый или стеклянный стаканчик, в который при тщательном размешивании постепенно доливается 20-30 г раствора детергента.Взвесь оставляется на 1 сутки или центрифугируется в течение 1-2 мин при 1000-1500 об/мин. На дне сосуда образуется трехслойный осадок. Нижний слой содержит тяжелые частицы, средний - более легкие и яйца гельминтов, верхний - наиболее легкие хлопья. Пастеровской пипеткой 1-3 капли содержимого среднего слоя переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом или целлофановой пленкой и микроскопируют. На одном предметном стекле готовят два препарата.

Метод Горячева. Применяется обычно для выявления тяжелых яиц трематод, которые не всплывают при исследовании кала по методу Фюллеборна. При этом обнаруживаются яйца и других гельминтов. В цилиндр диаметром 1,5-3 см и высотой 20 см наливают 100 мл насыщенного раствора хлористого натрия (или 22% раствора азотнокислого калия). Комочек кала (0,5- 1,0 г) тщательно размешивают в 20-25 мл воды и медленно фильтруют через воронку с двумя слоями марли, наслаивая фильтрат сверху на солевой раствор и избегая перемешивания. Образуются два разграниченных слоя. По мере отстаивания яйца с небольшим количеством частичек кала оседают на дно цилиндра. Через 2-3 часа верхний слой с калом отсасывают пипеткой, а оставшийся солевой раствор оставляют еще на 12-20 часов или центрифугируют. Осадок забирают пипеткой и исследуют под микроскопом.

В.А. Золотухин для массовых обследований предложил проводить отстаивание в центрифужных пробирках, используя небольшие объемы жидкостей. Суспензия кала готовится в 3-4 мл воды, а солевой раствор наливается в центрифужные пробирки в количестве 3-5 мл. В остальном исследование проводится как обычно.

   Крупные яйца печеночной двуустки и шистосом в значительном количестве задерживаются на марлевых фильтрах, поэтому для их выявления используют мелкие металлические сетки или мелкоячеистый мельничный газ.

Метод повторного отстаивания. Проба фекалий массой 20-30 г смешивается с 250 мл воды, процеживается через очень мелкую сетку (чулочный трикотаж, мельничный газ) в цилиндр или конический сосуд и отстаивается в течение 30 мин. Затем надосадочная жидкость сливается; до первоначального объема добавляется чистая вода, сосуд встряхивается и смесь снова отстаивается. Процедура повторяется до тех пор, пока верхний слой жидкости не станет прозрачным. После этого из осадка делаются мазки на предметных стеклах и микроскопируются.Метод применяется преимущественно для выявления яиц трематод.

Исследование дуоденального содержимого. В желчи и дуоденальном содержимом могут быть обнаружены яйца гельминтов, находящихся в печени, поджелудочной железе или двенадцатиперстной кишке: яйца различных двуусток, анкилостомид, кишечной угрицы, а также яйца аскарид при извращенной локализации этих паразитов в печени.

Полученный при зондировании субстрат после внешнего осмотра центрифугируется, осадок переносится на предметное стекло и микроскопируется. Если в надосадочной жидкости обнаруживаются хлопья, в которых могут содержаться яйца гельминтов, то исследуется не только осадок, но и эти хлопья. При наличии больших количеств слизи и гноя субстрат перед центрифугированием смешивается с равным объемом эфира.

Исследование мокроты. В мокроте могут быть обнаружены яйца легочной двуустки; очень редко встречаются личинки аскарид, анкилостомид и элементы эхинококкового пузыря (крючья, обрывки оболочки кисты, выводковые капсулы со сколексами). Для их выявления исследуются нативные мазки. В ряде случаев гнойная мокрота смешивается при этом с О,5% раствором едкого натра или с 25% антиформином. Смесь на 1-1,5 ч помещают в термостат, затем центрифугируют и микроскопируют осадок.

   Яйца глистов характеризуются следующими особенностями независимо от вида паразита: а) определенным размером;

б) специфической формой;

в) различной структурой оболочки;

г) своеобразной внутренней организацией (эмбриональные крючья, различное число бластомеров, наличие желточных кле­ток, филаметов и пр.). Указанные признаки позволяют распо­знать яйца паразитических червей и отличить их от похожих образований, могущих ввести наблюдателя в заблуждение. Не­опытный исследователь иногда принимает за яйца червей сильно преломляющие свет пузырьки воздуха, круглые, блестящие ка­пельки жира, плоские и овальные растительные клетки, споры, зерна детрита, кольца растительных сосудов и пр. Структура подобных образований бывает однородной, оболочка или отсут­ствует, или никогда не бывает сложного строения. Полезно лег­ким движением покровного стекла изменить положение наблюдаемого объекта, что дает возможность составить о нем более полное представление. Следует отметить, что в испражне­ниях иногда можно обнаружить яйца клещей (мучных, сырных);

белые яйца этих клещей (0,12х0,08 мм) эллиптической формы с широкоовальными полюсами, тонкая оболочка их легко дает складки, содержимое однородно; на поздних стадиях раз­вития яйца имеют личинку. В сомнительных случаях прибегают к измерению подозрительных объектов.

   Для сохранения фекалий с яйцами глистов их тщательно смешивают в равном объеме с горячим 10% раствором форма­лина, или прибавляют его к фекалиям после получасового нагре­вания их в водяной бане при 60°; высокая температура исключает возможность в дальнейшем развития яиц нематод до стадии личинки.

Определительная таблица яиц паразитических червей, имеющих медицинское значение (цифры, стоящие вне скобок и в скобках, указывают, под каким номером определительной таблицы расположены взаимноисключающие друг друга признаки яиц паразита).

1(16) На верхнем полюсе яйца имеется крышечка.

2(3) Яйца обнаруживаются преимущественно в мокроте. Яйца золотисто-коричневые с толстой оболочкой. На верх­нем полюсе находится глубоко лежащая крышечка, на противоположной стороне оболочка утолщена и образует небольшой выступ. Форма и размеры яиц довольно изменчивы (61—81 к 48—54) ..... Трематода легочная (парагонимус).

3(2) Яйца находят в испражнениях.

4(7) Длина яиц свыше 100.

5(6) Овальные яйца желтого цвета (130—145Х70—85), обо­лочка толстая и гладкая. Яйцеклетка окружена мно­гочисленными желточными клетками. На нижнем по­люсе находится плоский бугорок ......... . . . . . . Трематода печеночная (фасциола)

6 (5) Крупные яйца бледно-серого цвета (130—140х80—85). На нижнем полюсе, противоположном крышечке, имеется плоское линейное утолщение яйцевой скорлу­пы ............. Фасциолопсис

7(4) Длина яиц меньше 100.

8(9) Размер яиц 68—75Х75—50. Отношение длины к ширине 1,5:1. Яйца сероватые и широко-овальные. Оболочка относительно тонкая, гладкая с небольшим бугорком, расположенным слегка асимметрично на нижнем по­люсе. Яйцевая клетка окружена желточными клетка­ми ............ Лентец широкий

9 (8) Яйца мелкие (не свыше 45).

10 (15) Яйца с бугорком на нижнем полюсе.

11 (14) Выступы оболочки по краям крышечки хорошо выра­жены.

12 (13) Яйца мелкие (26— 32Х11—19), бледно-желтые, отно­шение длины к ширине 2,5:1. На нижнем полюсе на­ходится мелкий конусовидный выступ. Зародыш мел­козернистый. Трематода кошачья (описторхис)

13(12) Яйца мелкие (27—35Х12—19), желто-коричевые. Нижняя половина яйца заметно расширена. На сто­роне, противоположной крышечке, имеется развитый бугорок . . . Трематода китайская (клонорхис).

14(11) Выступы оболочки вокруг крышечки слабо выражены. Яйца мелкие (26,5—28Х 1&,5—17), столстой светло-коричневой оболочкой. На нижнем полюсе хорошо заметный бугорок ........ Метагинимус

15(10) Яйца без бугорка на нижнем полюсе, с толстой темно-бурой оболочкой (38—45Х25—30). Мирацидий с двумя крупными клетками ...........Трематода ланцетовидная (дикроцелиум)

16(1) На верхнем полюсе яйца крышечка отсутствует.

17(18) Яйца асимметричные (50—60Х30-32): одна сторона заметно уплощена, другая выпукла. Оболочка тон­кая, гладкая и бесцветная. Яйца на различных стади­ях дробления до головастнкоподобной личинки вклю­чительно . ............ Острица

18(17) Яйца симметричные

19(30) Яйца не содержат эмбриальных крючьев.

20 (21) Яйца овальные или веретеновидные, с концевым или боковым шипом ......... Шистозомы

а. Яйца с концевым шипом (112—170Х40—70). Встре­чаются обычно в моче и реже в испражнениях . . . ............ Шитозома кровяная

б. Яйца с мощным боковым шипом (114—175Х45—68) Обнаруживаются в испражнениях и реже в моче . . ............ Шистозома Мэнсона

в. Яйца с небольшим боковым крючковидным или руди­ментарным шипом (70—100Х50—65). Обнаружива­ются только в испражнениях... Шистозома японская

21(20) Яйца без концевого или бокового шипов.

22(23) Форма яиц лимоноподобная. Оболочка темно-коричне­вая, толстая; на обоих полюсах яйца светло-окрашен­ные пробковидные образования. Мелкозернистые (50—54Х23—26) ........ Власоглав

23(22) Форма яиц овальная, реже почти шаровидная.

24(27) Наружная оболочка бугристая.

25(26) Оболочка крупнобугристая, темно-желтая. Шаровид­ная, мелкозернистая яйцеклетка находится в середи­не яйца и никогда не заполняет все яйцо (50—70 X40—50) . . Аскарида(оплодотворенное яйцо)

26(25) Оболочка мелкобугристая и более тонкая. Яйцо чаще удлиненное (50— 100Х40— 50). Форма его изменчи­ва, часто неправильная. Все внутреннее пространство под оболочкой заполнено большим количеством жел­точных зерен.... Аскарида (неоплодотворенное яйцо)

27(24) Оболочка гладкая, тонкая и бесцветная с округленны­ми полюсами.

28(29) Форма яйца правильно овальная. Оболочка тонкая, прозрачная; яйца выделяются на стадии четырех бластомеров, не заполняющих яйцо полностью (56—76Х34—40). . . . Анкилостома и Некатор

29(28) Форма яйца овально-эллипсоидная с более узким верх­ним полюсом; выделяются они из кишечника на ран­них стадиях развития 16—32 бластомера (73—80X40—43) ......... Трихостронгил

30(19) Яйца содержат зрелый зародыш (онкосфера) с шестью эмбриональными крючьями.

31(34) Оболочка онкосферы без радиальной исчерченности.

32(33) Яйца овальные (40—50). Бесцветная оболочка их тон­кая и гладкая. Эмбриофора почти шаровидная (29— 30) с длинными нитевидными придатками на полю­сах ..........  Цепень карликовый

33(32) Оболочка онкосферы (эмбриофора) не имеет нитевид­ных придатков на полюсах. Яйца крупные (60—80Х Х72—86), почти сферической формы с толстой жел­товатой двуконтурной оболочкой. Диаметр эмбриофоры: 38Х28 . . . . . . . Цепень крысиный

34(31) Яйца(эмбриофоры) почти шаровидные, желто-корич­невые, оболочка их толстая с радиальной исчерченностью (31—40Х20—30 ) ............... Цепень вооруженный и невооруженный

ПРИМЕЧАНИЕ:

1) Изредка встречаются яйца. аскарид без наружной белковой (бугристой) оболочки.

2) В летнее время свежевыделенные яйца анкилостомид (анкилостома, некатор) и трихостроягилид через сутки уже могут содержать личинки.

3) В экскрементах встречаются не яйца этих паразитов, а эмбриофоры со зрелыми зародышами (онкосферы); наружная яйцевая оболочка, окружающая эмбриофору, легко разрушается и практически отсутствует.

Измерение яиц паразитических червей

В затруднительных случаях при определении яиц глистов прибегают к их измерению Практически это бывает необходимо при нахождении яиц паразитических червей, сравнительно редко встречающихся в наших широтах, например анкиластомид, трематод и др. Для микроскопического измерения необходимо иметь: а) микрометрический окуляр и б) объективную микро­метрическую линейку. Микрометрический окуляр отличается от обычного наличием в нем измерительной линейки длиной 1 см с делениями в 0,1 мм; следует указать, что при наложений окулярного микрометра видимая величина каждого деления окулярной линейки будет различна в зависимости от увеличения микроскопа, т. е. длины его тубуса и оптической системы. Для определения линейного значения делений окулярной линейки для данного микроскопа применяется объективная микрометрическая линейка; последняя помещена на специальном предметном стекле и имеет обычно длину в 10 мм, причем каждый миллиметр разделен на 100 рав­ных частей, следовательно, каждое деление равно 0,01 мм. Вста­вив микрометрический окуляр в микроскоп и поместив объектив­ную линейку на предметный столик, производят установку микроскопа, т. е. помещают объектив на определенном расстоя­нии от предметной линейки, дающем наиболее ясную видимость. Видимые в поле зрения линейки (окулярная и объективная) накладывают в вертикальном положении одна на другую и уста­навливают число делений микрометрического окуляра, точно совпадающее с определенным числом делений объективной линейки, после чего вычисляют в микронах величину одного деления окулярной линейки.

Пример. 26 делений окулярного микрометра соответствуют 10 деле­ниям объективной линейки. Так как каждое деление последней равно 0,01 мм, то 26 делений окулярного микрометра равны 0,1 мм и отсюда, следовательно, величина одного деления окулярной линейки будет равна 0,00385 мм (0,1:26), двух делений — 0,00770 мм и т. д. Для точности измерения рекомендуется пользоваться силь­ными оптическими системами и вычислять деления до пяти десятичных знаков. В дальнейшем для производства регулярных измерений объективная линейка уже не требуется и для посто­янной работы с данным микроскопом пользуются заранее соста­вленной таблицей. При измерении какого-либо объекта сменяют обыкновенный окуляр на микрометрический и, определив в делениях последнего длину и диаметр объекта, находят в таблице искомую величину в микронах.

Исследование мяса на личинок трихинелл методом переваривания

Кроме распознавания мышечного трихинеллеза способом раздавливания мяса между двумя предметными стеклами или стеклянными пластинками (в компрессории) в практиче­ской работе, особенно для экс­периментальных целей, приме­няют переваривание исследуе­мого мяса желудочным соком. Ю. А. Березанцев  предложил для этого прибор, состоящий из шести конусо­видных воронок, каждая из которых с верхним диамет­ром 4,5 см и высотой 12—13см при диаметре нижнего отвер­стия 0,8 см. В воронку встав­ляют железную сетку с отверстием 0,5—1 мм, а на ниж­ний конец воронки наде­вают мягкую резиновую труб­ку, снабженную зажимом Мора. Воронки фиксируют в приборе вместе с центрифужными пробирками. Мелконарезанное и предварительно взвешенное мясо (1—3 г) помещают на сетку воронки в натуральный или искусственный желудочный сок (1% пепсина и 0,5%: соляной кислоты); каждая воронка вмещает 60 мл желудочного сока. Прибор ставят в тер­мостат при температуре 37°. Через 16—24 часа жидкость из воронки выпускают в пробирки и центрифугируют. Осадок исследуют под микроскопом. Личинки трихинелл в воде при комнатной температуре сохраняются живыми до 15 дней, а в фи­зиологическом растворе единичные личинки живут свыше месяца.

Исследование почвы на яйца паразитических червей

Пробы почвы для исследования берутся на дворе, в подва­лах, сенях, сараях, саду; исследуют пол жилища, сор после подметания школ,  и т. д. Рекомендуется с участка в 50 м2 брать по диагонали не менее десяти проб почвы. Затем смеши­вают взятые пробы вместе и исследуют из общей массы 200 г земли. Для обработки почвы можно применять следующие методы.

Способ Спиндлера. 10 г земли помещают в центрифужную пробирку емкостью в 50 мл3, прибавляют около 10 мл3 30% антиформина, тщательно размешивают и оставляют на час в по­кое; затем избыток антиформина сливают и землю смешивают с насыщенным раствором двухромокислого натра (удельный вес 1,35), наполняя пробирку почти доверху; после основательного размешивания центрифугируют в течение 1—2 минут (при 1000 оборотах в 1 минуту).

   Вместо насыщенного раствора двухромокислого калия дру­гие авторы рекомендуют применять насыщенный раствор поваренной соли, или 2,13% раствор едкого натра, или насыщенный раствор азотнокислого натра (удельный вес1,39). Всплывшие на поверхность после центрифугирования яйца снимают петлей, считают и классифицируют по стадиям разви­тия: а) яйца не развившиеся, б) развившиеся, находящиеся в различных стадиях дробления, в) зрелые с подвижной личинкой и г) мертвые.

Способ Васильковой-Гефтер  дает значи­тельно лучшие результаты. В центрифужную металлическую пробирку (50 см3) помеща­ют 10,0 г исследуемой почвы, опускают 10 стеклянных бусинок, наполняют пробирку 5% раствором едкого натрия и в течение часа 4—5 раз энергично встряхивают пробирку для лучшего размешивания почвы. После центрифугирования в течение 1—2 минут избыток едкого натра сливают. Затем пробирку наполняют насыщенным раствором азотнокислого натрия (удельный вес 1,39) и после повторного размешивания почвы центрифугируют в течение 2 минут. Поверхностную пленку переносят петлей в стаканчик с не­большим количеством воды, землю в пробирке размешивают с тем же раствором азотнокислого натра и снова снимают поверхностную пленку, повторяя эту процедуру до пяти раз в те­чение 4—5 часов. Воду со снятой поверхностной пленкой фильтруют через один планктонный предварительный фильтр в воронке Гольдмана; при отсутствии последней воде дают отстояться или ее центрифуги­руют, а затем осадок микроскопируют. Влажный фильтр исследуют под микроскопом; если же его предварительно подсушивают, то затем просветляют кедровым, вазелиновым или касторовым маслом. Яйца подсчитывают и оп­ределяют стадии их развития. Авторы этого способа указывают, что через один фильтр можно профильтровывать пленку после обработки 100—200 г почвы, что соответствует 10—20 центрифужным пробиркам. Про­смотр одного фильтра занимает не более 3—4 минут. При такой методике исследования почвы обнаруживается от 34 до 60% яиц паразитических червей (в среднем 44,6%).

   Т. К. Масольниковой  предложена следующая шкала сравнитель­ной оценки степени загрязнения почвы яйцами паразитических червей: почва считается незагрязненной при количестве яиц гельминтов от 0 до 50 в 1 кг почвы; слабо загрязненной—от 51 до 150; сильно загрязненной—от 151 до 300; очень сильно загрязненной—от 301 и более.

Гельминтологическое исследование овощей

Описанный принцип исследования почвы на зараженность ее яйцами глистов положен 3. П. Васильковой и В. А. Гефтер (1941) в основу гельминтологического исследования овощей. Овощи замачиваются на сутки в стеклянных банках, причем рекомендуется их тщательно взбалтывать в течение 5 минут не менее четырех раз в час. Затем воду через металлическую сетку сливают, в другую банку и в новой порции воды производят соскоб с овощей кисточкой из металлических струн. Обе порции воды сливаются вместе и отстаиваются сутки. Обработку осадка производят так же, как при анализе почвы. Применяется также и другой способ исследования овощей; последние замачивают лишь на 2 часа в 2% растворе щелочи, осадок же после отстаи­вания сразу обрабатывают насыщенным раствором азотнокис­лого натра.

Гельминтологическое исследование воды

   В зависимости от характера источника водопользования (мелкие или крупные водоемы со стоячей или проточной водой, ручьи, оросительные канавы, пруды, озера, реки) применяются более или менее сложные способы гельминтологического иссле­дования воды.

   Исследование воды из оросительных канав— арыков. В арыке устанавливают большую воронку, имеющую форму конусовидного ведра, без дна; вместо последнего ведро снизу затягивают двумя слоями марли, между которыми находится -слой ваты. Такую воронку с фильтром устанавливают так, чтобы текущая вода фильтровалась через марлю и вату. Через сутки осадок с фильтра распределяют по стаканчикам и исследуют по способу Фюллеборна. Небольшие по объему пробы воды можно фильтровать через простую или обеззоленную фильтровальную бумагу; затем фильтры разрезают на кусочки по размеру покровного стекла и после просветления в кедровом или гвоздичном масле микро­скопируют. При возможности испытуемую пробу воды центрифу­гируют: незначительный осадок распределяют на несколько предметных стекол и микроскопируют, большой осадок исследу­ет по способу Фюллеборна. По 3. Г. Васильковой, фильтрацию воды производят в воронке Гольдмана с водоструйным насосом или с ручным насосом Шинца через мембранный крупнопористый («предварительный») фильтр, который затем исследуют под микроскопом во влажном состоянии, или после подсушивания на воздухе с последующим просветлением. По этому способу требуется час для фильтрации 10 л речной воды при смене 10—20 фильтров. Этот же метод применяется для гельминтологического исследования сточных вод; при этом в час, в зависимости от объема осадка, фильтруется от 2 до 3 л сточной воды. При гельминтологическом исследовании текучих и стоячих естественных водоемов (реки, озера, пруды, болота) воду можно фильтровать через ткань с ячейками диаметром не более 0,02—0,03 мм (3. Г. Василькова). Для взятия проб воды употребляют гидробиологическую планктонную сетку, в дно которой вставлена широкая стеклянная или металлическая трубка. На отогнутые наружные края трубки прикреп­ляют резиновым или металлическим кольцом двойной  фильтр. Пробы воды берут с глубины 5—20 см. В зависимости от густоты осадка влажный фильтр после расправления на стекле сразу же исследуют под микроскопом, а обильный осадок—по способу Фюллеборна с 48% раствором азотнокислого натра.

Исследование предметов бытовой обстановка

   Для выяснения степени загрязнения яйцами глистов различ­ных предметов бытовой обстановки (мебель, школьные парты, полы, ручки дверей, игрушки и т. п.) поступают следующим образом. Акварельной кисточкой, смоченной в 10% растворе глице­рина, проводят несколько раз по исследуемому предмету, после чего кисточку помещают в пробирку, в которую наливают ди­стиллированную воду; тщательно вымытую в этой же воде кис­точку просматривают под микроскопом; содержимое же пробир­ки центрифугируют. Для гельминтологического исследования пыли с предметов обихода с успехом можно применить электропылесос. В пылесосе  обычный шланг со щетками заменяют шоттовской воронкой № 1 с пористой пластинкой, на которую помещают предварительный мембран­ный фильтр; последний после извлечения микроскопируют во влажном состоянии. Смыв со стенок воронки фильтруют в при­боре Гольдмана. При наличии большого количества пыли на фильтре, его обрабатывают по способу Васильковой-Гефтер. предложенному для исследования почвы.

Систематика гельминтов, паразитирующих у  человека и  млекопитающих

   Систематику гельминтов еще нельзя считать устоявшейся, постоян­но происходят более или менее значительные ее изменения. Кроме того, до сих пор нет руководства, в котором была бы изложена полностью система всех классов гельминтов. Поэтому для облег­чения работы начинающих исследователей мы приводим систему (до семейства) гельминтов, паразитирующих у  человека  и млеко­питающих. В целом она соответствует системе, изложенной Шульцем и Гвоздевым (1970). В систематике приводятся первооткрыватели той или иной систематической единицы номенклатуры гельминтов

Надтип Scolecida (Huxley, 1856) Bekleniischev, 1944

Тип Plathelmintlies Schneider, 1873

Класс Trematoda Rudolphi, 1808

Подкласс Prosostomidea Skrjabin et Guschanskaja, 1962

Отряд Fasciolida Skrjabin et Guschanskaja, 1962

Подотряд Fasciolata Skrjabin et Schuiz, 1935

Семейства:

 Fasciolidae Railliet, 1895

Brachylaemidae Stiles et Hassal, 1898

Dicrocoeliidae Looss, '1899

Hasstilessidae Hall, 1916

Lecithodendriidae Odhner, 1911

Nanophyetidae Dollius, 1938

Paragonimidae Dollius, 1938

Plagiorchidae Luehe, 1901

Psilostomidae Odhner, 1960

Troglotrematidae Odhner, 1914

Подотряд Echinostomatata Szidat, 1936

Семейство Echinostomatidae Dietz, 1909

Подотряд Heterophyata Morosov, 1955

Семейства: Heterophyidae Odhner, 1914

Opisthorchidae Braun, 1901

Подотряд Paramphistomatata (Szidat, 1936) Skrjabin et Schuiz, 1937

Семейства:

Paramphistomidae Fischoeder, 1901

Cladorchidae Southwell et Kirschner, 1937

Gastrodiscidae Stiles et Goldberg, 1910

Gastrothylacidae Stiles et Goldberg, 1910

Подотряд Pronocephalata Skrjabin, 1955

Семейство Notocotylidae Luehe, 1909

Подотряд Schistosomatata Skrjabin et Schuiz, 1937

Семейство Schistosomatidae Looss, 1899

Отряд Strigeida (La Rue, 1926) Sudarikov, 1959

Подотряд Strigeata La Rue, 1926

Семейство Alariidae Tubangui, 1922

Класс Cestoidea Rudolphi, 1819

Подкласс Eucestoda Southwell, 1930

Отряд Pseudophyllidea Carus, 1863

Семейство Diphyllobobothriidae Luehe, 1910

Отряд Cyclophyllidea Beneden in Braun, 1900

Подотряд Anoplocephalata Skrjabin, 1933

Семейства:

Anoplocephalidae Cholodkowsky, 1902

Avitellinidae Spassky, 1950

Catenotaeniidae Spassky, 1950

Linstowiidae (Mola, 1929) Spassky, 1949

Подотряд Hymenolepidata Skrjabin, 1940

Семейства:

Hymenolepididae (Ariola, 1899)

Dilepididae Fuhrmann, 1907

Dipylliidae Mathevosian, 1953

Подотряд Mesocestoidata Skrjabin, 1940

Семейство Mesocestoididae Perrier, 1897

Подотряд Taeniata Skrjabin et Scuhiz, 1937

Семейство Taeniidae Ludwig, 1886

Тип Acanthocephales (Rudolphi, 1808) Skrjabin et Schuiz, 1931

Класс Acanthocephala (Rudolphi, 1808)

Подкласс Echinorhynchinea Petrotschenko, 1956

Отряд Polymorphida Petroschenko, 1956

Семейство Polymorphidae Meyer, 1931

Подкласс Giganthorhynchinea Petrotschenko, 1956

Отряд Giganthorhynchida Southwell et Macfie, 1925

Семейство  Giganthorhynchidae Hamann, 1892

Отряд Oligacanthorhynchida Petrotschenko, 1956

Семейства:

Oligacanthorhynchidae Southwell et Macfie, 1924

Moniliformidae Van Cleave, 1924

Тип Nemathelminthes Schneider, 1866

Класс Nematoda Rudolphi, 1808

Подкласс Adenophorea (Linstow, 1905) Dougherty,1958

Отряд Dioctophymidea Yamaguti, 1961

Подотряд Dioctophymata Skrjabin, 1927

Семейства:

Dioctophymidae Railliet, 1915

Soboliphymidae Petrow, 1930

Отряд Trichiuroidea Yamaguti, 1961

Подотряд Trichocephalata Skrjabin et Schuiz, 1928

Надсемейство Trichocephaloidea Skrjabin et Schuiz, 1928

Семейства:

Capillariidae Neveu-Lemaire, 1936

Trichinellidae Ward, 1907

Trichocephalidae Baird, 1853

Trichosomoididae Yorke et Maplestone, 1926

Подкласс Secernentea (Linstow, 1905) Dougherty,1958

Отряд Spirurida Chitwood, 1938

Подотряд Spirurata Railliet, 1914

Надсемейство Spiruroidea Railliet et Henry, 1915

Семейства:

Spiruridae Oeriey, 1885

Habronematidae Ivaschkin, 1961

Histyocephalidae Skrjabin, 1961

Надсемейство Physalopteridea Sobolev, 1949 in Skrjabin, Sobolew, Schikhobalova, 1949

Семейство Physalopteridae Leiper 1908

Надсемейство Thelaziidea Sobolev, 1949 in Skrjabin, Sobolew, Schikhobalova, 1949

Cемейства:

Theiaziidae Skrjabin, 1915

Gongylonematidae Sobolev, 1949 in Skrjabin, Sobolew, Schikhobalova, 1949

Pneumospiruridae Wu et Hu, 1938

Rictuiariidae Railliet, 1916

Подотряд Ascaridata Skrjabin, 1915

Надсемейство Ascaridoidea Railliet et Henry, 1915

Семейство Ascarididae Baird, 1853

Надсемейство Anisakoidea Mosgovoy,1950

Семейство Anisakidae Skrjabin et Karokhin, 1945

Подотряд Camallanata Chitwood, 1936

Надсемейство Dracuncuioidea Gameron, 1934

Семейство Dracunculidae Leiper, 1912

Надсемейство Gnathostomatidea Skrja­bin et Ivaschkin, 1968

Семейство Gnathostomatidae Railliet, 1895, emend. Nicoll, 1927

Подотряд Filariata Skrjabin, 1915

Надсемейство Filaroidea (Weinland, 1858)

Семейства: Filariidae Gobbold, 1879

Dipetalonematidae Wehr, 1935

Setariidae (Yorke et Maplestone, 1926) Skrjabin et Schikhobalova, 1945

Stephanofilariidae Wehr, 1935

Надсемейство Aproctoidea (Yorke et Moplestone, 1926) Sonin, 1962—1963

Семейство Splendidofilariidae (Ghabaud et Choquet, 1953) Sonin, 1962—1963

Отряд Rhabditida (Oerley, 1880) Chitwood, 1933

Подотряд Rhabditata Chitwood, 1933

Надсемейство Rhabditoidea Travassos, 1920

Семейство Strongyloididae Chitwood et Mclntosh, 1934

Подотряд Oxyurata Skrjabin, 1923

Надсемейство Oxyuroidea Railliet, 1916

Семейства:

Oxyuridae Cobbold, 1864

Heteroxynematidae Skrjabin et Schikho­balova, 1951

Syphaciidae Skrjabin et Schikhobalova, 1951

Надсемейство Cosmocercoidea Skrja­bin et Schikhobalova, 1951

Семейство Cosmocercidae Travassos 1925

Надсемейство Heterakidoidea Chabaudr 1957

Семейство Heterakidae Railliet et Henry, 1914

Надсемейство Subuluroidea Travassos,.1930

Семейство Subuluridae Yorke et Maplestone, 1926

Подотряд Strongylata Railliet et Henry, 1813

Надсемейство Strongyloidea Weinland, 1853

Семейства:

Strongylidae Raird, 1853

Ancylostomatidae Baylis et Dubney, 1926

Syngamidae Leiper, 1912

Trichonematidae Witenberg, 1925

Надсемейство Metastorongyloidea La­ne, 1917

Семейство Metastrongylidae Leiper, 1908

Надсемейство Pseudolidoidea Skrjabin et Ivaschkin, 1968

Семейства: Crenosomatidae Schulz, 1951

Filaroididae Schuiz, 1951

Protostrongylidae Leiper, 1926

Надсемейство Trichostrongyloidea Cram, 1927

Семейства: Trichostrongylidae Leiper 1912

Dictyocaulidae Skrjabin, 1941

Heligmosomatidae Cram, 1927

Ollulanidae Skrjabin et Schikhobalova,. 1952

Иммунитет при паразитарных заболеваниях

   Увеличение числа людей, пораженных паразитарными болезнями, нарастаю­щие изменения окружающей среды в развивающемся мире и неудачи при исполь­зовании классических программ по борьбе с инвазиями стимулировали поиск но­вых подходов к ликвидации этих болезней. Определенную роль в этом должна сыграть иммунология. В настоящее время специалисты изучают несколько аспек­тов взаимодействия паразита и хозяина. Предпринимаются попытки определить механизмы, позволяющие паразитам избегать иммунного конфликта с хозяином, изучить механизмы иммунного ответа, обусловливающие патологические изме­нения. Иммунологические методы лежат в основе разработки диагностических тестов и, в конечном счете, дают надежду на получение эффективных вакцин против некоторых из этих болезней. В настоящее время не существует вакцины для защиты людей от инвазии, несмотря на наличие ряда эффективных вакцин против паразитарных болезней животных. Наиболее целесообразным представляется рассмотрение проблемы получения противопаразитарных вакцин на при­мере малярии.

   Вакцина против малярии. Несмотря на то что предпринимаются попытки создать вакцины против многих паразитарных болезней, особенно интенсивная работа осуществляется в отношении вакцины против малярии, вызываемой Plasmodium falciparum, наиболее злокачественным возбудителем. Для правильного понимания проблемы и подходов к ней необходимо кратко рассмотреть жизнен­ный цикл возбудителя малярии. При укусе комара в кровь человека попадают подвижные спорозоиты, находящиеся в слюнных железах насекомого. Менее чем за 30 мин они покидают кровь и проникают в печень. Далее споро­зоиты проходят экзоэритроцитарный цикл развития, претерпевая бесполое деле­ние по типу шизогонии и продуцируя множество мерозоитов. Последние при разрыве гепатоцитов выходят в кровь и проникают в эритроциты, где дифферен­цируются в трофозоиты, делятся по типу шизогонии с образованием большого числа мерозоитов, которые вновь проникают в эритроциты, и цикл продолжается. Некоторые мерозоиты развиваются в половые стадии, гамонты. Если комар уку­сит зараженного человека, гамонты попадут в организм насекомого. Мужские микрогаметы оплодотворяют женские макрогаметы, формируется оокинета, а затем ооциста. Последующее деление в пределах ооцисты приводит к образова­нию инфективной стадии, спорозоита. Некоторые из этих стадий могут быть ми­шенью для иммунного воздействия с помощью вакцины.

   Спорозоитные вакцины. Иммунитет к Р. falciparum можно сооб­щить человеку через возбудителя, находящегося на стадии спорозоитов. Это было показано в опытах с облученными зараженными комарами (содержащими облученных спорозоитов, потерявших способность к делению), которым давали возможность напитаться кровью людей. В результате исследований появилась воз­можность охарактеризовать один спорозоитный антиген. Моноклональные анти­тела к этому антигену могут пассивно переносить резистентность к малярии у грызунов и обезьян. С помощью методики рекомбинантной ДНК клонирован ген, ответственный за кодирование протективного спорозоитного антигена Р. falcipa­rum. Протективный эпитоп состоит из .4 аминокислот, повторяющихся 23 раза. Эта повторяющаяся последовательность может быть синтезирована для разработ­ки вакцины. Преимуществами спорозоитной вакцины является то, что она эффек­тивна без адъюванта и обладает протективным действием против различных форм Р. falciparum. Недостатком ее можно считать то, что иммунитет характе­ризуется феноменом «все или ничего»; если несколько спорозоитов избегут иммун­ного ответа, человек может заразиться малярией.

   Мерозоитная вакцина. Организм хозяина вступает в контакт с мерозоитами в течение короткого промежутка времени, когда они покидают один эритроцит и проникают в другой. Зараженные эритроциты образуют на своей поверхности новые антигены, возможно, паразитарного происхождения. Мишенью для вакцины могут быть как мерозоиты, так и зараженные эритроциты. При пассивном переносе частичную защиту могут обеспечить моноклональные анти­тела к мерозоитам и эритроцитам, инфицированным возбудителем малярии гры­зунов. Эти моноклональные антитела были использованы для выделения анти­генов, способных индуцировать протективный иммунитет. Преимущество подоб­ной вакцины заключалось бы в ее эффективности против стадий паразита, взаимодействующих с организмом хозяина более длительный период времени, чем спорозоиты. В качестве недостатков можно рассматривать то, что для достиже­ния достаточного протективного эффекта требуются адъюванты, а также воз­можную штаммоспецифичность вакцины.

   Гаметная вакцина. В том случае, если в организме хозяина возни­кает иммунитет к гаметам (состояние, которое не встречается в естественных условиях, так как гамета изолирована от иммунного воздействия посредством эритроцитарной мембраны, антигаметные антитела при попадании (одновремен­но с гаметами) с кровью в организм переносчика могут нейтрализовать гаметы при освобождении последних из эритроцитов. По-видимому, по крайней мере два антигена участвуют в этом процессе, так как нейтрализация может иметь место, только когда два различных моноклональных антигаметных антитела дей­ствуют совместно, но не тогда, когда они действуют в отдельности. Вакцина, действие которой направлено против гамет, не обладает достаточным протективным эффектом от болезни, но может быть применена в целях снижения ее передачи. В этой связи имело бы смысл включить ее в состав мультивалентной вак­цины против малярии.

Механизмы, позволяющие паразитам избежать воздействия иммунного отве­та хозяина.

 У паразитов выработались различные механизмы ослабления воздействия иммунного ответа хозяина. Наиболее ярким примером этого служит механизм антигенных вариаций у африканских трипаносом — жгутиковых простейших, передаваемых мухой цеце, возбудителем сонной болезни. Трипаносомы имеет толстую поверхностную оболочку, состоящую из многочисленных молекул одного антигенного гликопротеина. Когда клонируемые организмы, имеющие один и тот же поверхностный антиген, вводятся определенным животным, начинается последовательное развитие волн паразитемии, сходных с теми. которые наблюдают у людей, подвергавшихся укусам зараженных мух цеце. Во время каждого пика преобладают трипаносомы, образующие один вариант порерхностного гликопротеинового антигена (ВПГА), отличного от всех других ВПГА, образованных во время предыдущих пиков паразитемии у того же живот­ного. Клонируемый организм может продуцировать волны возбудителя с более чем 100 различными ВПГА. Каждый пик паразитемии индуцирует выработку растворимых антител против основного ВПГА. Полагают, что антитела элиминируют возбудителей с наличием специфического ВПГА, но трипаносомы, кото­рые смогли переключиться на другие ВПГА, ускользают. Анализ последователь­ности аминокислот у ряда ВИГА показал, что они имели различия только по не­скольким замещениям, что может быть объяснено локальной мутацией, и, на­оборот, аминокислотная последовательность каждого ВПГА совершенно раз­лична.

   Исследования но генному кодированию ВПГА показали, что каждый ВПГА кодируется с помощью отдельных генов. Каждая трипаносома, несмотря на тип имеющегося в данный момент ВПГА, содержит копию каждого гена ВПГА. Трипаносомы обладают несколькими механизмами для экспрессии ВПГА. На­пример возбудители с экспрессией определенного гена ВПГА могут иметь до­полнительные,  дублирующие копии того же гена; это называется дублированием, связанным с экспрессией. Исследования с помощью рестрикционных ферментов показывают, что дублирование, связанное с экспрессией, перемещается на новое место, являющееся специфичным для экспрессии гена. Если каждый ген представить в виде магнитофонной кассеты в фонотеке, то для экспрессии ВПГА касета дублируется, дубликат забирают из фонотеки, вставляют в генетический магнитофон и проводят экспрессию.

   У некоторых паразитов выработалось множество механизмов, позволяющих  избежать воздействия иммунного ответа. Шистосомы, например, могут терять поверхностные антигены после того, как они попадают в организм хозяина; могут присоединять антигены хозяина и маскироваться под ткани хозяина; могут обра­зовывать определенные внутренние изменения мембраны, обеспечивающие им резистентность к воздействию иммунитета даже при наличии поверхностных антигенов, и, наконец, могут выделять антигены, блокирующие эффекторные клетки и антитела. Ряд паразитов, например токсоплазмозы, после заглатыва­ния макрофагом препятствуют слиянию фагосом с лизосомами. Другие, такие как лейшмании, не могут препятствовать слиянию после поглощения, но обладают устойчивостью к воздействию токсических субстанций в лизосомах макрофагов. Остальные, такие как Trypanosoma cruzi, избегают контакта с лизосомами в цитоплазме.

   Некоторые возбудители, такие как филярии, лейшмании и возбудители ма­лярии, индуцируют сильные супрессирующие механизмы, включающие Т-клетки-супрессоры, которые снижают или сводят к нулю эффективность иммунного от­вета хозяина. Некоторые паразиты могут разрушать медиаторы, участвующие в воспалительных реакциях, обеспечивающих эффективный иммунный ответ. Например, Taenia разрушают компоненты системы комплемента, амебы проду­цируют нейтрализующие факторы против хемотаксических факторов для макро­фагов. Другие паразиты, такие как аскариды, по-видимому, обладают поверх­ностным слоем, играющим роль антигена, и могут индуцировать иммунный ответ, но сами, несмотря ни на что, устойчивы к этому воздействию. Против этих пара­зитов эффективный иммунный ответ не формируется.

   Хотя некоторые паразитирующие организмы могут уклоняться от иммунного ответа, они обладают способностью индуцировать эффективный защитный им­мунный ответ к последующему заражению этими же видами. Это называется сопутствующим иммунитетом или нестерильным (инфекционным) иммунитетом.

   Эффекторные механизмы хозяина против паразитов. К числу эффективных механизмов, формирующихся против паразитов, относятся следующие: антитела;

цитотоксические Т-клетки; активированные Т-клетками макрофаги; естественные клетки-киллеры и различные клетки, ответственные за антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность. Сюда относится также усиление иммун­ной системы за счет действия лимфокинов и системы комплемента.

   Иммунитет против некоторых паразитов, таких как возбудители малярии, шистосомы и Trypanosoma cruzi, является гуморальным. Однако данные, полу­ченные моделированием на животных, позволяют заключить, что клеточные реак­ции также участвуют в развитии иммунитета против этих и других паразитов, включая возбудителей лейшманиозов, токсоплазмоза, шистосомозов, филяриатозов и трихинеллеза. В то же время не совсем ясно, развивается ли протективный иммунитет против амеб, африканских трипаносом или анкилостомид. Есть дан­ные о том, что не существует естественно приобретенного иммунитета против аскарид, ришты или Enterobius vermicularis (остриц).

   Известны два механизма иммунитета, которые, по-видимому, являются уни­кальными для гельминтозов. Во-первых, это эозинофилия, во-вторых — актив­ность антител класса IgE.

Эозинофилы и антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АДСС). Уже более 100 лет известно, что эозинофилия всегда сопутствует гельминтозам, но только в последние годы были получены данные, что эти клетки могут функционировать в качестве киллеров. Например, при взаимодействии с покрытыми антителами шистосомулами Schistosoma mansoni in vitro тщательно очищенные эозинофилы губительно действовали на личинок. Образовавшиеся антитела относились к классу IgG, и эозинофилы прикреплялись к Fс-участку IgG посредством клеточного Fc-рецептора. Иммунные комплексы или стафило­кокковый белок А, препятствующие связыванию эозинофилов с Fc-участками антител, ингибируют эту реакцию. Инкубация при температуре 37 °С делает взаимодействие между эозннофилами и покрытыми антителами шистосомулами необратимым. Это было связано с дегрануляцией и высвобождением главного белка, преобладающего белка в эозинофильной грануле, и эозинофильного катионного белка на поверхности шистосомул. Эти белки в свою очередь являются токсичными по отношению к личинкам. Эозинофилы также могут вызывать гибель других гельминтов, таких, как трихинеллы, по-видимому, с помощью сходного механизма.

   Эозинофилы больных с эозинофилией обладали способностью вызывать in vitro гибель шистосомул, покрытых антителами; они действовали так, как будто были активированы. Кроме того, имеются растворимые вещества, способные уси­ливать киллерную способность эозинофилов in vitro, К ним относятся стимули­рующий эозинофильный активатор (СЭА); ФКЭ-А, растворимая субстанция, сходная или идентичная фактору; стимулирующему рост колоний эозинофилов; растворимый медиатор, продуцируемый моноцитами и лимфоцитами крови в культуре.

Протективная роль антител класса IgE. Данные о том, что уровень антител класса IgE у некоторых представителей населения стран тропического региона, особенно у лиц, зараженных гельминтами, повышен, позволяют предположить, что IgE могут способствовать защите хозяина против паразитирующих организ­мов. Высвобожденные из активированных тучных клеток медиаторы способны действовать непосредственно на паразита или, увеличивая сосудистую проницае­мость и выделение эозинофильного хемотаксического фактора, могут вести к на­коплению необходимых антител (IgG) и клеток, воздействующих на паразита. IgE-иммунный комплекс может индуцировать макрофаг-опосредованную цитотоксичность к шистосомулам. У крыс со специфическим дефицитом IgE, обуслов­ленным повторными инъекциями антител с антиэпсилоновой цепью, наблюдали значительное снижение резистентности к заражению трихинеллами.

Иммунопатология. Роль иммунных механизмов в развитии многих парази­тарных болезней достаточно велика. Примерами этого могут служить гранулематозная реакция на яйца S. mansoni, являющаяся основой иммунопатологии при данной инвазии; наличие иммунных комплексов в случае заболевания почек при малярии и висцеральном лейшманиозе; болезни сердца, обусловленные Т. cruzi; непроходимость сосудов и поражение глаз при филяриатозах и онхоцеркозе; патологические изменения в мышцах при трихинеллезе; аллергические реакции на жидкость из разорвавшегося эхинококкового пузыря; поражение легких при миграции личинок нематод. Точно так же как механизмы супрессии вовлекаются в угнетение протективного иммунитета, они принимают участие в модулировании иммунопатологии. Это наблюдается, например, при модуляции гранулем S. mansoni Т-клетками-супрессорами.

   Моноклональные и антиидиотипические антитела. Моноклинальные антитела к различным стадиям малярийных плазмодиев могут быть использованы для выявления антигенов, способных индуцировать протективный иммунитет. Кроме того, пассивная защита обеспечивается с помощью моноклональных антител к промастиготам Leishmania mexicana и шистосомулам S. mansoni. С учетом их специфичности моноклональные антитела могут быть также использованы для диагностики, поскольку существует возможность отобрать их таким образом, чтобы они не давали перекрестных реакций с сыворотками животных, заражен­ных другими паразитирующими организмами. Например, получены видоспецифические моноклональные антитела, с помощью которых можно дифференцировать пять различных видов южноамериканских лейшманий при отсутствии перекрест­ных реакций с Т. cruzi. Антитела в сыворотках крови больных обычно перекрестно реагируют с антигенами всех названных возбудителей. В настоящее время разрабатываются диагностические тесты с использованием моноклональных антител.        Антитело к антигену содержит специфический уникальный в своем роде антиген, который связан с иммуноглобулином. Этот антиген, названный идиотипическим, обладает уникальной аминокислотной последовательностью и конфигурацией антигенсвязывающих участков этих антител. Например, можно создать антитело к определенному моноклональному антителу; такое антитело сможет распознавать идиотип и называется антиидиотипическим ан­тителом. Моноклональные антитела будут связываться с антиидиотипическим, или оригинальным, антигеном. Использование моноклональных антител для индуцирования антиидиотипического антитела позволило бы индуцировать протек­тивный иммунитет посредством этого антиидиотипа, а не с помощью антител. Преимуществом такого подхода явилось бы исключение необходимости очистки антигенов и последующей наработки их в больших количествах. Эта новейшая стратегия для производства вакцин находится на стадии изучения.

   Быстрые темпы исследования регуляторных систем иммунного ответа наряду с успехами в технологии способствует скорейшему появлению возможности со­здания более напряженного искусственного протективного иммунитета по сравнению с приобретенным естественным путем. Все это позволяет предположить, что удастся получить высокоэффективные вакцины против целого ряда возбуди­телей паразитарных болезней.

Иммуноферментная диагностика  паразитарных инвазий

   Основной отличительной чертой иммуноферментного анализа (ИФА) является то, что в качестве индикаторной молекулы, которая позволяет следить за иммунным комплексом, исполь­зуется молекула фермента. В связи с тем что фермент обладает уникальным свойством модифици­ровать не одну, как в обычных химических реакциях, а большое число молекул субстрата, т. е. обладает своего рода усиливающим свойством, чувствительность иммуноферментных методик может быть очень высока. В некоторых случаях, как показывают многочисленные сравнительные исследования, она выше чувствительности иммунофлуоресцентных и радиоиммунологических ме­тодов.

   История создания иммуноферментных методик начинается с момента, когда биохимики начали ковалентно иммобилизовывать («пришивать») молекулы ферментов к молекулам белков и, в частности, к молекулам иммуноглобулинов. Однако потребовалось пять лет для создания методики иммуноферментного анализа именно в том виде, в каком мы используем его в настоящее время. Принципы этого метода следующие:

— комплекс антиген — антитело можно выявить, если ввести в состав одного из участников иммунной реакции (ковалентно «пришить») одну или несколько молекул фермента. Причем эта процедура на промежуточных (в процессе «пришивки») и финальной стадии (конъюгат антигена или антитела с ферментом) не должна изменять иммунные свойства фермент-меченного участника иммунной реакции;

— удобно выявлять иммунный комплекс, используя способность фермента расщеплять суб­страт, который при ферментативной модификации изменяет свой цвет. В этом случае для выявле­ния комплекса антиген — антитело обычно используют спектрофотометрию;

— иммунный комплекс можно выявлять с помощью иммуноферментного анализа как в рас­творе, так и при адсорбции (или ковалентной иммобилизации) на твердом носителе.

Различают два принципиально различных типа ИФА — гомогенный и гетерогенный (твер-дофазный) иммуноферментный анализ.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) — наиболее простой в методическом от­ношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса анти­ген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного  разобщения фермента и субстра­та, либо за счет конформационных изменений в молекуле фер­мента , сопровождающих формирование иммунного ком­плекса

 ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими с иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия  (весь анализ с помощью ГИФА занимает минуты и даже доли минут).  . Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких этапов промывки. И, наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8—50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток — на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

   Гетерогенный (твердофазный) иммуноферментный анализ (ТФИФА или ELISA) в последние годы особенно широко используется в биологии и медицине. Как и для других твердофазных методов анализа, характерной особенностью ТФИФА является то, что в процессе проведения анализа один из участников реакции антиген — антитело иммобилизуется на твердом носителе. Эту фиксацию антигена или антител можно осуществлять либо путем их ковалентной «пришивки» к полимерной или стеклянной матрице, либо путем их физической адсорбции на твердом носителе за счет достаточно прочных сил электростатического и ван-дер-ваальсового взаимодействия. Идея иммобилизации иммунного комплекса важна для анализа многокомпонентных смесей макромоле­кул, когда в системе должны оставаться только те компоненты смеси, которые обладают нужными иммунохимическими свойствами. Именно твердофазные методики позволяют избавиться от бал­ластных, не вошедших в иммунный комплекс антигенов простой промывкой.

   Необходимо отметить, что в своей физико-химической основе твердофазный ИФА очень сходен с твердофазным РИА. Отличие касается лишь индикаторных молекул — в ТФИФА это фермент, в твердофазном РИА это радиоактивные изотопы. Остальные же принципы анализа полностью совпадают — в обоих методах используется твердая матрица, на которой адсорбирует­ся иммунный комплекс, и идентичный способ удаления из системы не вошедших в комплекс компонентов диагностикума. Поэтому многочисленные варианты различных схем анализа, приве­денные ранее для твердофазного РИА, могут быть использованы для описания методик анализа, применяемых при постановке ТФИФА.

    Для обнаружения в биологических и клинических образцах паразитарных анти­генов особенно часто применяется так называемый сэндвич-метод или модифицированный сэнд­вич-метод. При использовнии этих методик на твердую подложку (обычно полистирол) сорбируются последовательно первичные антитела, выявляемый антиген и вторичные антитела. В случае двойного сэндвич-метода ферментная метка вводится в состав вторичных антител, в случае модифицированного двойного сэндвич-метода вторичные антитела (немеченые) «проявляются» антивидовыми меченными ферментом иммуноглобулинами. Особая популярность последней раз­новидности ТФИФА объясняется тем, что для выполнения методики нет необходимости синтезиро­вать специфические для каждого конкретного антигена конъюгаты (меченные ферментом анти­тела).

   В последние годы были разработаны методики ТФИФА, использующие в качестве «проявля­ющих» конъюгатов молекулярные комплексы ферментов с белком А золотистого стафилококка. Как известно, это белок взаимодействует с высокой константой связывания с тяжелой цепью (Fc-фрагментами) иммуноглобулинов. Это позволяет построить диагностические системы, где в качестве «проявляющего» агента используются не антивидовые антитела, а белок А. В этом случае, однако, возникают некоторые трудности, связанные с неспецифичностью белка А, который взаимодействует с Fc-фрагментами любых антител. Если использовать обычную сэндвич-методи­ку, заменив лишь антивидовой конъюгат на конъюгат на основе белка А, последний будет взаимодействовать не только со вторичными антителами, но и с первичными иммуноглобулинами, давая положительную реакцию, даже если проба не содержит искомого антигена. В этом случае имеется несколько вариантов решения проблемы. Во-первых, в качестве первичных антител в ме­тодике можно использовать иммуноглобулины, с которыми белок А взаимодействует слабо (например, с мышиными иммуноглобулинами). Во-вторых, возможна прямая адсорбция антигена на полистирол, когда первичные антитела просто не используются. И, наконец, в качестве первич­ных антител можно применять не полные молекулы иммуноглобулинов, а молекулы, лишенные Fc-фрагментов, — так называемые Fab-фрагменты. В этом последнем случае дополнительным удобством методики будет являться то, что для конструирования диагностической системы можно будет использовать не две сыворотки» полученные от разных животных, а одну. Именно в связи с этими обстоятельствами в настоящее время разработано и разрабатывается большое число диагностических методик, использующих конъюгаты на основе белка А.

Постановка и учет результатов иммуноферментной  реакции (ИФР) 

   Постановку и учет иммуноферментной реакции, в качестве примера, можно представить в микроварианте ИФР, разработанного Белозеровым С.Н., Успенским А.В., Ждановой О.Б. (1997), с целью обнаружения противотрихинеллезных антител в сыворотке крови животных (песцов).  Нерастворимой основой служили планшеты из полистирола, при исследовании в ИФР  небольшого количества проб использовали стрипы. Для разведения антигена использовали комплексирующий 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6. Все виды биологических жидкостей (антиген, исследуемую сыворотку,  конъюгат) и субстрат  вносили в объеме 0,2 мл. Инкубировали антиген в течение  часа, с последующим его инкубированием  в холодильнике при +4  С в течение 16-20 часов. Планшеты отмывали от не связавшихся антигенов вначале водопроводной водой, потом 0,05%  раствором Твина на водопроводной воде. Такую операцию проводили после каждого этапа постановки реакции.

      Исследуемую сыворотку разводили 0,01 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ)  рН 7,2 с добавлением 0,05 %  раствора  Твина-40(20) и 0,05 %   альбумина и вносили в лунки планшета в раститровке (для определения минимального диагностического титра), либо в скрининг - титре, определенном для тест системы, а затем инкубировали в течение 30 минут при температуре      +37  С.                                                   

   Отрицательным контролем служила сыворотка крови здорового животного, а положительным сыворотка здорового песца, экспериментально инвазированного 10000 личинок трихинелл на животное, взятая на 35 день с момента инвазии.

        После отмывки от не связавшихся антител следующим этапом постановки ИФР было внесение конъюгата. Конъюгат вносили также в 0,01 М ФСБ рН 7,2 в рабочем разведении, испытанном предварительно для каждой серии конъюгата и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37о С, после чего проводили отмывку от не связавшегося конъюгата. Каждое инкубирование проводили во влажной атмосфере. Рабочее разведение для данной серии конъюгата было установлено  1:3000.

     Свежеприготовленную субстратную смесь (ортофенилендиамин в цитратном буфере) вносили в каждую лунку по 0,2 мл и выдерживали при комнатной температуре  30 минут в темноте. Реакцию останавливали, используя в качестве стоп-реагента концентрированную (0,9 моль/ л) серную кислоту, которую вносили в каждую лунку планшета по 50 мкл. Визуально оценку реакции проводили по интенсивности окрашивания лунок. Положительная реакция проявляется в виде потемнения субстратной смеси до красновато-бурого оттенка, в лунке сенсибилизированной антигеном, где инкубировалась сыворотка животного инвазированного Т. spiralis. При отсутствии изменения цвета реакцию оценивали как отрицательную.   При   незначительном  изменении   цвета  субстратной  смеси                                               (при бледно-желтой окраске) реакцию оценивали, как сомнительную и сыворотку повторно  исследовали в ИФР.                                                                                              Так как, при использовании ортофенилендиамина (ОФД) в качестве  субстрата,  окраска  в  случае  положительной  реакции имеет красноватый оттенок, то при учете реакции на спектрофотометре   использовали длину волны 492 нм. Регистрацию результатов ИФА проводили немедленно после остановки пероксидазной активности на спектрофотометре.

  Определение минимального специфического титра  ИФР при трихинеллезе.

    Минимальным специфическим титром считали такой, при котором наблюдали выявление пероксидазной активности по изменению цвета субстрата от насыщенного желтого до темно - бурого с сыворотками экспериментально инвазированнми личинками трихинелл песцов, но изменение цвета субстрата отсутствовало или было весьма незначительным (до бледно-лимонного) с гетерологическими (зараженных другими гельминтозами) сыворотками и сыворотками здоровых животных. 

Методы генного зондирования

Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной методической базы генетических исследований явились основой генетической инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается направление по определению специфических нуклеотидных после­довательностей ДНК и РНК, зонд с меткой так называемое генное зондирование. В основе подобных методик лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации—образованию двухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных  нуклеотидов (А-Т, Г-Ц). Для  (или РНК) специально создается, так называемый, зонд-полинуклеотид с определенной последовательностью оснрований. В его состав вводят специальную метку позволяющую идентифицировать образование комплекса. Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется теми же спосо­бами, что и индикаторные методы иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его фенотипической экспрессии. Первые сообщения об использовании зондов были связаны с чисто исследовательскими задачами молекулярной биологии — контролем наличия тех или иных последовательностей ДНК в общем пуле клеточной ДНК. Различают несколько разновидностей генного зондирования: гибридизация по Саузерну (анализ ДНК), Nothern-blot (анализ РНК), точечная гибридизация, гибридизация in situ (на срезе, в мазке).

   Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью получения одноцепоч­ных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК- или РНК-зонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК (или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного патогенного организма), как правило представленные в виде генетических последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда — препараты РНК, особенно часто — рибосомальная РНК (Stull Т. et al., 1988).

   В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных видах иммунохимичес­кого анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотин (с дальнейшим проявлением ком­плексом авидин-фермент) и т. п.

   Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда. В исследователь­ских лабораториях используют ДНК-зонды, приготовленные самостоятельно и меченые, как правило, радиоактивным фосфором. В настоящее время все чаще применяются коммерческие наборы, содержащие все необходимые ингредиенты.

   В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего — полимерный мембранный фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание несвязавшихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата ДНК- или РНК-зонда предварительно проводится его получение и введение метки.

   Проводится и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т. е. переход ее в одноцепочную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновых кислот фиксируют на носителе — нитроцеллюлезной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80 С в вакууме. Далее, в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч, в зависимости от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размера.

После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит радиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с фотопленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующие процедуры. Например, известен метод определения модифицированных участков ДНК с помощью антител (Stollar В., Rashtchian A., 1987), введением в состав зонда низкомолеку­лярных компонентов (биотин, дигоксин и т. п.) с последующим проявлением конъюгатом авидин-фермент, антитело-фермент (van Brunt J., Klausner A., 1987).

Если Вам понравилась эта лекция, то понравится и эта - 2.2.Картография средневековья.

   Первые сообщения о коммерческих образцах наборов для генного зондирования появились в 1986 г. — ими стали наборы для определения М. pneumoniae, L. pneumoniae. Затем появились наборы для индентификации других патогенов.

   Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называемых — холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридизации, позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пунктатов ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибридизация in situ).

   Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось использование полимеразной реакции амплификации (PCR). Этот подход позволяет увеличить концентрацию определенной (заранее известной) последовательности ДНК в пробе за счет синтеза многочислен­ных копий in vitro. Для проведения реакции к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат фермента ДНК-полимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для синтеза и, так называемые, праймеры — два типа олигонуклеотидов величиной 20—25 оснований, соответствующих концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Один из праймеров должен быть копией начала участка считывания кодирующей цепи ДНК при направлении считывания 5—3, а второй — копией противоположного конца некодирующей цепи. Тогда при каждом цикле полимеразной реакции происходит удвоение количества ДНК-копий.

   Для осуществления связывания праймеров необходима денатурация ДНК (плавление) при 94°С с последующим доведением смеси до 40—55°С. В первом сообщении, описывающем метод, полимеразу добавляли вновь после каждого взаимодействия праймеров с ДНК, так как фермент не выдерживал нагревания до 94°С. В настоящее время чаще используют ДНК- полимеразу термофильной бактерии Т. aquaticus, выдерживающую такую температуру и имеющую максимум активности при 70°С.

   Для проведения реакции сконструированы программируемые инкубаторы микропроб, позво­ляющие легко чередовать изменения температуры, оптимальной для каждого этапа реакции.

    Методы, связанные с использованием генного зондирования безусловно, будут более широко внедряться в практику диагностики паразитарных заболеваний по мере их упрощения и удешевления.