Диссертация (Влияние компонентов сигнального пути HEDGEHOG на пролиферацию и химиорезистентность низкодифференцированных глиом), страница 5

А при рецидивах глиобластомы после терапиихимиотерапевтическими препаратами наблюдалась гиперэкспрессия GLI1 [95].Существует предположение, что среди глиобластом встречаются как НН-зависимые, так иНН-независимые опухоли. Для НН-зависимых глиобластом характерна повышенная активностьNotch и PDGFR сигнальных путей. Для второй группы характерно понижение экспрессии PTЕN(фосфатаза с двойной субстратной специфичностью) c увеличением активности PI3K-AKTсигналинга [16]. Возвращаясь к результатам рассмотренного выше исследования, можнопредположить, что отсутствие экспрессии GLI1 в глиомах IV степени злокачественности моглобыть обусловлено наличием НН-независимых глиобластом [16].

Повышение активности PI3KAKT сигналинга и уменьшение экспрессии PTEN, что отмечается при НН-независимыхглиобластомах, связывают с неблагоприятным прогнозом и более инвазивным ростом опухоли[96].Активный сигнальный путь НН характерен для PTEN-позитивных глиобластом, гдеотмечается повышение экспрессии генов GLI1 и Shh, в сравнении с глиобластомами безэкспрессии PTEN. В случае отсутствия экспрессии PTEN, как правило, активен PI3K-AKTmTOR сигнальный путь, что в силу невыясненных механизмов может способствоватьинактивации HH сигнального пути [16].В случае глиом IV степени злокачественности экспрессия гена PTCH1 не превышаеттаковую в норме, в то время как сам ген является целевым для транскрипционного фактораGLI1 [36, 94].

В случае глиом I, II, III степени злокачественности наблюдается увеличениеэкспрессии PTCH1 до 2, 6 и 9 раз, соответственно, что также подтверждено при помощиметодики вестерн-блоттинг. Более 87% PTCH1 позитивных клеток также оказались Bmi-1позитивными, что указывает на то, что PTCH1 может являться маркером прогениторных клетокглиом [94]. Помимо глиобластомы уменьшение уровня экспресии PTCH1 наблюдается в линияхмедуллобластомы [36].Другой коллектив исследователей обращает внимание на неоднозначность результатов,полученных как при помощи ПЦР-РВ, так и иммунофлуоресцентных методик, и предлагает вкачестве метода оценки активности сигнального пути и GLI1 анализировать в сравненииэкспрессию репортерного гена люциферазы.

Авторы обнаружили отсутствие корреляции междуэкспрессией GLI1 и активностью репортерного гена в клеточных линиях глиобластом. Кроме22того, уровень активности репортерного гена был максимальным в линии Т98, где уровеньэкспрессии GLI1 соответствует первичным образцам и ниже, чем в U-87 MG. В качествевозможной причины такого несоответствия авторы предполагают ингибирование синтеза GLI1на уровне трансляции. Таким образом, высокая экспрессия транскрипционного фактора еще неозначает большое количество самого фактора и высокую активность НН сигнального пути [97].Следовательно, не всегда верно оценивать активность НН сигналинга по экспрессиитранскрипционного фактора GLI1.В исследованиях с мышиной PDGF-индуцированной глиомой, растущей в среде ссывороткой, функционирование GLI1/2 оценивалось по активности репортерного геналюциферазы.

Культивирование клеток с лигандом Shh не повышало продукцию люциферазы.Это оценивалось как неактивное состояние НН сигналинга. Если же опухолевые клеткикультивировали в условиях образования нейросфер в среде с добавлением EGF и bFGF,наблюдалась высокая активность GLI1/2 [98]. Следовательно, культивирование клеточныхлиний в среде, содержащей сыворотку, может способствовать инактивации НН сигналинга [93,94, 98]. Аналогичные результаты представлены и для культур медуллобластомы, где в клеткахотмечалось уменьшение активности фактора GLI1 [99].Результаты активации НН сигналинга при добавлении факторов EGF, FGF, LIFспособствовали изучению HH сигналинга в CD133-позитивных клетках и туморосферах, гдеповышен синтез Shh и увеличен уровень SMO [93, 100]. Добавление циклопамина и другихингибиторов НН сигналинга приводило к снижению сферообразования, пролиферации иснижению GLI1 [59, 93, 101]. Дополнительное внесение Shh сказывалось на увеличениисферообразования, повышении экспрессии генов GLI1/2 и SMO [59, 102].

Все эти данныесвидетельствуют о вовлечении НН сигналинга в процессы формирования стволовыхопухолевых клеток и онкогенеза при глиобластомах.Любопытные данные были продемонстрированы в исследованиях на мышах с PDGFиндуцированной глиомой, где было показано, что лиганд Shh определяется не в самихопухолевых клетках, а преимущественно в эндотелиоцитах и астроцитах, окружающихопухоль.

Но в нормальных эндотелиоцитах мозга зрелой мыши не отмечается экспрессия Shh.Такие же данные были получены и при анализе первичных образцов человеческойолигодендроглиомы и глиобластомы. Авторы предполагают, что за счет паракриннойрегуляции лигандом Shh клетки, окружающие опухоль, влияют на активность НН сигналинга вклетках самой опухоли [4, 98]. Многие авторы предполагают, что дополнительно впериопухолевом пространстве источником паракринной регуляции Shh могут служитьнейрональные и неопластические клетки [59, 93-95, 98, 103]. При этом в самих клетках23опухоли, лиганд Shh отсутствует или его количество снижено [104]. Однако есть данные, чтоклетки глиомы способны к самостоятельному синтезу лиганда [93].Интересные данные были получены и при совместном культивировании клеточныхкультур глиобластомы GL261 и эндотелиоцитов b.ЕND3.

Кокультивирование клеток GL261 иb.ЕND3. приводило к тому, что в эндотелиальных клетках повышалась экспрессия Shh и GLI1 ипонижалась экспрессия HHIP [105]. Одновременно с этим в клетках глиобластомы GL261наблюдалось увеличение количества CD133-позитивных клеток, повышение способностиобразовывать сферы и увеличение уровня экспрессии GLI1 и генов, связанных с процессамистволовости. Похожие результаты были получены и при совместном культивировании клетокглиобластомы U-251 MG с эндотелиальными клетками HUVEC.

При этом ингибирование ННсигналинга как в клетках глиобластом, так и в эндотелиоцитах нивелировало вышеописанныеэффекты [105, 106].Можно предположить, что клетки глиобластомы способны запускать синтез лиганда Shh вэндотелиальных клетках, что ведет к активации НН сигнального пути в клетках опухоли. Поодной из версий, влияние GL261 на эндотелиальные клетки происходит через VEGFопосредованную стимуляцию [105, 106].1.5 Ингибирование и активация сигнального пути HedgehogОбнаружено более 200 веществ, способных ингибировать сигнальный путь HH [7].Соединения можно разделить в зависимости от механизма действия (ингибирование SMO, GLI1или Shh и т.д.) и от природы соединения (натуральные природные вещества, синтетическиепродукты и другие вещества, к которым можно отнести витамин D3 и антитела к компонентамНН пути) [7, 107].Особенность ингибиторов SMO заключается в том, что, ингибируя рецептор SMO, ониуменьшают активность классического сигнального пути HH.

При этом транскрипционныефакторы GLI могут регулироваться посредством влияния других сигнальных путей [108]. Кингибиторам SMO относится наиболее популярный ингибитор циклопамин, его производные идругие вещества [7]. Циклопамин является алкалоидом, выделенным из ядовитого растения V.californicum, способным ингибировать сигнальный путь НН за счет связывания с одним издоменов SMO [109].24Во множестве исследований на мышах моделей человеческой глиомы, меланомы, ракапростаты, прямой кишки и поджелудочной железы циклопамин показал свою эффективностьингибирования роста опухоли [67, 110-112]. Несмотря на это, циклопамин из-за своейтоксичности и побочных эффектов не будет применяться в терапии онкологическихзаболеваний [113].

Поэтому в настоящее время ведутся работы по созданию производныхциклопамина, которые будут лишены этих недостатков. Некоторые соединения хорошозарекомендовали себя в исследованиях in vitro, однако по исследованиям in vivo нельзя датьоднозначную оценку этим ингибиторам [108, 114, 115].Вторым по применению ингибитором трансмембранного рецептора SMO являетсявисмодегиб, или GDC-0449, относящийся ко второму поколению производных циклопамина.Данный препарат в настоящее время применяется для лечения метастатической формыбазальноклеточной карциномы [116]. Однако после применения висмодегиба в течениенескольких месяцев в клетках опухоли возникали мутации в SMO, которые приводили кнеэффективности терапии. Аналогичные наблюдения были отмечены и при медуллобластоме[117, 118].

В связи с этим идет поиск молекул, которые связывались бы со множеством сайтовна SMO, что позволит преодолеть развивающуюся в процессе терапии резистентность квисмодегибу. Одним из таких веществ является MRT-92 [119]. В настоящее время применениевисмодегиба в качестве монотерапии или в комбинации с другими химиотерапевтическимипрепаратами применяется в клинических исследованиях при лечении медуллобластомы,мелкоклеточного рака легкого, метастатического рака поджелудочной железы, менингиомы,глиобластомы и острого миелоидного лейкоза [108]. Увеличивается количество исследованийряда других ингибиторов SMO: эрисмодегиб, саридегиб, гласдегиб, таладегиб, CUR61414 [108].Ингибиторы транскрипционных факторов GLI инактивируют как сам сигнальный путьHH, так и нивелируют влияние на транскрипционные факторы GLI других сигнальных путей.Наиболее популярным ингибитором данного типа является GANT-61, для которого висследованиях на клеточных линиях рабдомиосаркомы, остеосаркомы, нейробластомы и ракаяичников была показана возможность ингибировать GLI1 и GLI2, препятствуя их связыванию смолекулами ДНК [34, 120-122].

В то время как ингибиторы SMO уже проходят клиническиеиспытания, GANT-61 используется только в экспериментальных работах.Другим популярным ингибитором GLI1/2 факторов является триоксид мышьяка. Онприменяется в терапии острого промиелоцитарного лейкоза и проходит клинические испытаниядля лечения солидных опухолей и гематологических опухолей [108, 123]. Свою эффективностьтриоксид мышьяка показал в исследованиях in vitro и in vivo на клетках рабдомиосаркомы, ракапростаты, поджелудочной железы и прямой кишки [108].25В экспериментальных исследованиях применяют также ингибиторы лиганда Shh.Наиболее популярными являются RU-SKI 43, нарушающий процессы синтеза лиганда, иантитела 5E1 к Shh [108].