Диссертация (Регенеративные и протекторные эффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при химических и механических травмах кожи), страница 2

et al.,2009].Известно,чтопроцессырегенерацииповрежденнойтканирегулируются различными эндогенными факторами, такими как VEGF, KGF,FGF, EGF и др. [Maddaluno L. et al., 2017; Xu H.L. et al., 2017; Choi S.M. et al.,2018; Tsui H.Y. et al., 2018]. В данной работе в качестве активатора7регенерационныхпроцессовиспользовалисьпаракринныефакторымезенхимальных стволовых клеток (МСК), в состав которых входятперечисленные факторы в разном соотношении, в результате чего ониобладаютпрорегенеративным,противовоспалительнымиантиапоптотическим действиями [Khubutiya T.S.

et al., 2014; Kim J.M. et al.,2018].Цельисследования:выявитьрегенеративныеипротекторныеэффекты экзогенного пероксиредоксина 6 и паракринных факторовмезенхимальных стволовых клеток при лечении химических и механическихтравм кожиЗадачи исследования:1. Провести сравнительную характеристику динамики регенерациикожного покрова при химическом ожоге и механической полнослойнойкожной ране;2.

Оценить эффективность применения экзогенного пероксиредоксина6 и паракринных факторов МСК на процессы регенерации тканей прилечении химического ожога и механической полнослойной кожной раны;3. Оценить эффективность совместного применения экзогенногопероксиредоксина 6 и паракринных факторов МСК в процессе регенерациитканей при лечении химического ожога и механической полнослойнойкожной раны.Теоретическая и практическая значимость работыРезультатыпроведенныхисследованийимеютфундаментальноезначение для расширения представлений о важности нейтрализацииокислительного стресса в минимизации повреждения кожи и ускоренияпроцессов пролиферации в процессе заживления ран различной этиологии.8Результаты данной работы могут быть применены при разработкепрепаратов для стимуляции процессов регенерации кожных поврежденийразличной этиологии.Научная новизна1.

Впервые установлено протекторное и регенеративное действияэкзогенного фермента-антиоксиданта пероксиредоксина 6 при заживлениихимической и механической кожной раны, при этом антиоксидантныйэффект пероксиредоксина 6 в процессе заживления ран кожи определяетсяего пероксидазной активностью.2.Впервыевыявленомощноепрорегенеративноедействиепаракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при заживлениикак химической, так и механической кожной раны.

Использованиепаракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток увеличивалосодержание фибробластов в ране и тем самым ускоряло процесс созреваниягрануляционной ткани, что способствовало сокращению сроков заживленияран.3. Впервые показан эффект совместного применения ферментаантиоксидантамезенхимальныхпероксиредоксинастволовыхклеток6инапаракринныхзаживлениефакторовхимическойимеханической полнослойной кожной раны. Совместное использованиепероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовыхклеток обеспечивает наиболее оптимальные условия для заживленияожоговых и механических ран.Положения, выносимые на защиту1. Как химический ожог, так и механическая полнослойная рана кожи впервые сутки вызывает разрушение тканей, которое сопровождаетсямощным окислительным стрессом, увеличением концентрации оксида азотаи увеличением уровня клеточного апоптоза в пораженной коже.2.Пероксиредоксин6в процессезаживленияхимическойимеханической кожной раны способствует нейтрализации окислительного9стресса, снижению уровня клеточного апоптоза, уменьшению концентрациивоспалительныхцитокинов,атакжеулучшениюваскуляризациигрануляционной ткани в пораженной коже.3.

Эффект пероксиредоксина 6 определяется его пероксидазнойактивностью, что показано при использовании его мутантного аналогаPrx6C47S, не обладающего пероксидазной активностью.4. Паракринные факторы МСК в процессе заживления химической имеханической кожной раны способствуют снижению уровня апоптоза иповышению пролиферации клеток, а также – к уменьшению концентрациипровоспалительных цитокинов и увеличению содержания фибробластов вобласти раневого дефекта.5.

Совместное использование пероксиредоксина 6 и паракринныхфакторов МСК обеспечивает наиболее оптимальные условия для заживленияожоговых и механических травм кожи, а именно: подавляет окислительныйстресс, уменьшает уровень апоптоза, увеличивает пролиферацию клеток, атакжеуменьшаетконцентрациюпровоспалительныхцитокиноввпораженной ткани, способствуя сокращению сроков регенерации в 2–3 раза иоказывая тем самым наилучший терапевтический эффект.6.Эффективностьпоражения кожи:используемыхпрепаратовзависитоттипапероксиредоксин 6 – при химическом ожоге кожи,препарат паракринных факторов МСК – при механической полнослойнойкожной ране.

Третий же препарат – комбинация фермента антиоксидантапероксиредоксина 6 и паракринных факторов мезенхимальных стволовыхклеток,–независимоотэтиологиираныоказываетнаилучшеетерапевтическое действие.Личный вклад автораВсеэкспериментальныеисследования,описанныевработе,статистическая обработка результатов, а так же анализ литературных данныхвыполнены автором самостоятельно.10Апробация диссертацииМатериалыВсероссийскаядиссертациинаучнаябылипредставленыконференцияснаконференциях:международнымучастием«Перспективы развития химических и биологических технологий в 21-мвеке». Саранск, 2015; V съезд биофизиков России.

Ростов-на-Дону, 2015;Российско-германский форум «Russian-German BioTech-2015». Пущино,2015; II и III Национальный Конгресс по регенеративной медицине. Москва,2015, 2017; XV Всероссийское совещание с международным участием и VIIIшкола по эволюционной физиологии. Санкт-Петербург, 2016; XXIVМеждународная молодежная научная конференция студентов, аспирантов имолодых учёных «Ломоносов», секция «Физиология человека и животных».Москва, МГУ, 2017; 20 и 21-я Международная Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология – наука XXI века».

Пущино, 2016,2017; V Съезд Российского общества патологоанатомов с международнымучастием. Челябинск, 2017; XXIII съезд Физиологического общества имениИ. П. Павлова. Воронеж, 2017. Апробация диссертации была проведена насовместном заседанииФГБУН «Институт биофизики клетки» РАН иФГБОУ ВО «Тульский государственный университет».ПубликацииПо материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в томчисле 6 статей в рецензируемых журналах и 11 тезисов докладов.Структура и объем диссертацииДиссертационная работа изложена на 137 страницах и состоит извведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и ихобсуждения,заключения,выводовиспискалитературы.Работаиллюстрирована 3 таблицами, 33 рисунками.

Список литературы включает203 источника (14 отечественных и 189 зарубежных).11I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1. Морфология, функции и особенности регенерации кожиКожа - самый большой орган тела. Она составляет около 15% от общеймассы тела взрослого человека и обеспечивает защиту от внешнихфизических, химических и биологических агентов. Она также играет роль втерморегуляции. Кожа состоит из трех слоев: эпидермиса, дермы игиподермы (подкожно-жировая клетчатка) (рис. 1).Рис.

1. Строение кожи [Gartner L.P. and Hiatt J.L.; 2007]1.1. Морфология кожиКожа является высоко васкуляризированным органом. Существуетобширная сеть кровеносных сосудов и капилляров, которые простираются отрегиональных отделений системного кровообращения до местных мест повсей кожной подкожной клетке и дерме, соответственно.

Кроме того,существует обширная лимфатическая структура, которая протекает вдоль12многих кровеносных сосудов кожи, особенно тех, которые прикреплены квенозному концу капиллярных сетей. [Harvey C., 2005]Эпидермис состоит из эпителиальных клеток. Среди этих клетокможно найти как живые клетки, так и мертвые (рис.2). Новые клетки на днеэпидермиса быстро делятся и подталкивают старые клетки вверх. Вэпидермисе нет прямого источника кровеносных сосудов для обеспеченияпитания. Питательные вещества поступают в эпидермис за счёт диффузиинеобходимых молекул из сосудистой сети, лежащей в основе дермы.Эпидермальные клетки связаны десмосомами.

Десмосомы находятся вконтакте с внутриклеточными кератиновыми пленками, которые производяткератин. Кератиновые клетки накапливаются и сшиваются с другимикератиновыми клетками в цитозоле во время их созревания. После того, какболее старые клетки погибают, эта сеть кератиновых фиброзов остается иобеспечивает мощный защитный слой в эпидермисе, называемый защитнымороговевшим слоем. Этот слой водонепроницаем и герметичен. Этопредотвращает попадание и вывод большинства веществ. В пораженнойкоже,особенноожогах,разрушаетсяэпидермис,приводящийкпотенциальной потере жидкости организма и повышению восприимчивостик микробным инфекциям, что приводит к смертельным последствиям[Sherwood L., 2007].Типы клеток эпидермиса: Кератиноциты - это основные типы клеток в эпидермисе (95% клеток) Меланоциты - это клетки-пигменты-продуценты, которые обнаруженыв базальном слое эпидермиса КлеткиЛангерганса-этиклеткиявляютсяважнымииммунологическими клетками, так же могут также находиться в дерме Клетки Меркеля - эти клетки находятся в базальном слое эпидермиса иявляютсячастьюдекарбоксилирования.системыпредшественникааминаи13Эпидермис состоит из пяти слоев, а именно изнутри наружу:базальный, шиповатый, зернистый, блестящий и роговой слои (рис.

2).Роговой слой является самым большим слоем эпидермиса и имееттолщину 10-20 мкм (в сухом состоянии) и 40 мкм (при гидратации). Роговойслой имеет структуру «кирпича и раствора». В этой модели кератин-богатыекарнеоциты (кирпичи) сидят во внутриклеточной липид-богатой матрице(растворе) [El Maghraby G.M. et al., 2008]. Корнеоциты (кирпичи) создают85% рогового слоя, а внутриклеточные липиды (15%).

Роговой слой состоитиз 70% белков, 15% липидов и только 15% воды [Nino M. et al., 2010].Рис.2. Структура эпидермиса [Бетехтин М.; 2016]Молекулы могут проникать через кожу двумя разными путями. Первыйпуть называется трансапендегелярным маршрутом. На этом пути молекулыдолжны проникать сквозь кожу, проникая сквозь потовые железы и черезволосяные фолликулы. Количество молекул, которые могут проникать черезэтот путь, очень ограничено. Второй путь проникновения через кожу - этотрансепидермальный путь. В этом пути молекулы должны проходить через14роговой слой как многослойный барьер двумя способами: внутриклеточными трансцеллюлярным путем [El Maghraby G.M.

et al., 2008].Базальнаямембрана является границей между эпидермисом идермой. Основными компонентами базальной мембраны являются коллагентипаIV,ламинин,Мезенхимальныеипротеогликанэпителиальныесульфатаклеткигепаринасекретируютиэнактин.компонентыбазальной мембраны и, таким образом, ответственны за его синтез и развитие[Ko M.S.

and Marinkovich M.P., 2010]. Хотя основная функция базальноймембраны заключается в закреплении клеток эпидермиса, лежащих в основедерме, взаимодействия между компонентами базальной мембраны иэпителиальными клетками оказывают важное влияние на клеточнуюфункцию, включая пролиферацию, миграцию и дифференцировку. Базальнаямембрана также является значительным фактором ангиогенеза, и, такимобразом, её белки ускоряют дифференцировку эндотелиальных клеток.Дерма расположена под эпидермисом и характеризуется множествомэластиновых волокон, которые обеспечивают растягивающую способность, атакже много коллагена, который обеспечивает прочность кожи. Кровеносныесосуды, обнаруженные в дерме, обеспечивают питательные вещества как длядермы, так и для эпидермиса.