Диссертация (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 6

Прирепаративных процессах в очаге воспаления, при фиброзе регенерация клеток ифиброплазия достигаются как активацией процессов пролиферации и усиленнойэкспрессииимиKi–67,определяющегомолекулярно-стратегическуюстратификацию злокачественных опухолей [379, 392, 430, 456, 483, 484], так иограничением апоптоза клеток, являющимся основным механизмом удаленияклеток в ходе различных этапов заживления ран [20, 181, 204, 205, 401]. Основные32регуляторы апоптоза включают каспазы, Bcl-2, Вах, р53 и фокальные киназыадгезии (FAK).

Каспазы представляют собой семейство цистеин-зависимыхаспартат-направленных протеаз и являются неотъемлемой частью апоптоза.Каспазы могут быть либо инициаторами, либо эффекторами апоптоза, взависимости от того, где они включаются в апоптотическую цепь. Bcl-2 являетсяпрототипом антиапоптозного белка, так как он блокирует привлечение иактивацию проапоптотических белков в митохондриях, таких как Вах.

FAKингибирует активность р53 через транскрипцию р21, в то время как Вах и Mdm-2функционируют посредством белок-белковых взаимодействий с p53. NOD2 иATG16L1(генаутофагии)такжеэкспрессируются миофибробластамииповышают апоптоз посредством индукции активации каспазы [320, 351, 514].Пролиферация и апоптоз ECM - продуцирующих клеток - важный пункт вфиброгенезеипоискевозможныхновыхцелейдлятерапевтическоговмешательства.

Некоторые методы лечения демонстрируют потенциальнуюантифиброгеннуюэффективностьпосредствомрегуляциипролиферациимезенхимальных клеток и апоптоза [459, 485, 567].Процессзаживленияранявляетсяпопыткойвосстановленияповрежденных структуры и функции ткани. Однако в отличие от острых ранхронические незаживающие раны не проходят этот линейный ряд событий.Разные области хронических ран находятся в различных фазах одновременно ипереход к следующему этапу не происходит скоординированно [475]. Конечнымрезультатом этого является нарушение заживления ран и накопление лишнейматрицы, так называемое рубцевание. Наиболее очевидным примером этогоявляется формирование в коже гипертрофических и келоидных рубцов [429, 472,557].

Патологический фиброз и рубцевание внутренних органов также можетсуществовать в течение долгого времени [390].331.1.4. Физиологические основы кальциевого гомеостаза:каналы и насосы мембран фибробластов,внутриклеточные кальций-связывающие белкиОдним из ведущих мессенджеров, опосредующих большинство клеточныхсобытий, является кальций Ca2+.

Участие кальция в регуляции основной функциифибробластов – строительстве соединительной ткани и, в частности, продукцииколлагена – доказано [33, 297, 359, 461]. Многие факторы роста и цитокинывызывают увеличение [Ca2+]в фибробластах [474]. Фармакологическоенарушение Ca2+ гомеостаза фибробластов используется в исследованиях, чтобысвязать корреляцию изменений концентрации Ca2+ с различными клеточнымиреакциями, в том числе синтезом белка, активацией факторов транскрипции,миграцией, жизнеспособностью клеток и пролиферацией [496]. В большинствеклеток в состоянии покоя существует 10000-кратный градиент концентрации дляCa2+через плазмалемму. Этот градиент поддерживается Ca2+помпой,гидролизующей АТФ, чтобы обеспечить энергию для движения Ca2+ противэлектрохимическогоградиента.[423].ТамтакжеможетбытьNa+/Ca2+теплообменник, который использует энергию, содержащуюся в градиентеконцентрации Na+ (в свою очередь, созданной Na+/K+ -АТФазой) для выведенияCa2+ из клетки.

Разнообразные внутри- или внеклеточные сигналы вызываютлокальныйростконцентрацииСа2+.Последнийвзаимодействуетсвнутриклеточными Са-связывающими белками, большая часть которых служитлибо трансмембранными переносчиками Са2+своеобразныйбуфердляподдержаниявнутри клетки, либо создаетнизкогоуровеняконцентрациивнутриклеточного Са2+. Структура таких белков в процессе связывания Са2+практически не измененяется. Существуют также регуляторные Са-связывающиебелки, структура которых в процессе связывания Са2+ заметно измененяется.Следствием изменения структуры и активности Са-связывающих белков-мишенейслужат разнообразные клеточные реакции: изменение формы, перемещение впространстве, ускоренный синтез АТФ и иных соединений, срочно необходимых34клетке, переход от покоя к ускоренной пролиферации и пр. По мере пониженияуровня Са2+ в цитоплазме до исходного уровня с участием специальныхтранспортных АТФаз, комплексы Са2+ и Са-связывающих белков диссоциируют,белки перестают взаимодействовать со своими мишенями, клетка переходит всостояние покоя.Внеклеточный Са2+ попадает в клетку через множество ионных каналов.Некоторые из них являются высокоселективными для Ca2+ и непроницаемы длядругих катионов (особенно одновалентных катионов, таких как Na+ и K+), тогдакак другие селективны для катионов, но тем не менее исключают ток анионов[412].НекоторыеоткрываютсяпривысокоселективныедеполяризацииCa2+мембраны,каналыаактивируютсятакжемогутилипроявлятьчувствительные к напряжению инактивационные характеристики.

Эти инезависимые от напряжения Са2+ селективные каналы можно отличить наосновании их характеристик активации, деактивации и инактивации [480]. Крометого,ониобладаютразличнойчувствительностьюкширокойфармакологических средств [546]. Три конкретных подтипа Ca2+палитреканалов, поимеющимся данным, особенно существенны в патогенезе фиброза [414]. Ca2+каналы Т-типа служат «кардиостимуляторами» ритмической активности вразнообразных типах клеток. Эти каналы активируются относительно небольшоймембранной деполяризацией и потом так же быстро инактивируются. Онигенерируют относительно небольшой и кратковременный пульсовой приток Ca2+,который затем может вызвать другие Ca2+-опосредованные и/или зависимые отнапряжения клеточные события [467, 531].

L- тип Ca2+ каналов играет ключевуюроль во многих типах клеток, где они опосредуют изменения уровня Ca2+ в ответна тонкие изменения мембранного потенциала, в том числе, порожденные Ттипом Ca2+ каналов. Деполяризация мембраны и накопление Ca2+в устье этихканалов в свою очередь становится причиной задержки инактивации каналов,обеспечивая отрицательную обратную связь для этого Ca2+ -выводящего пути[548].35Некоторые внутриклеточные органеллы экспрессируют Ca2+ помпы насвоих мембранах и тем самым накапливают Ca2+ в концентрациях столь жевысоких как во внеклеточном пространстве, а так же имеют ионные каналы,которые могут высвобождать этот сохраненный Ca2+ в управляемом режиме вответ на определенные раздражители [415]. Эндоплазматический ретикулум (ER),например, экспрессирует Ca2+ помпу (SERCA), а также два типа ионных Са2+каналов.Одинизнихоткрывает инозитолтрифосфат(IP3),вторичныймессенджер, образующийся под действием фосфолипазы С [448].Многие клеточные процессы Са2+ -зависимы.

Одна из стратегий,используемая многими клетками – «манипулирование» Ca2+ в разных частяхклетки, когда повышение концентрации Ca2+ в одной части клетки регулируетопределенную функцию, в то же время уменьшая Ca2+ в другом участке клетки,чтобы подавить другую функцию [458, 534]. Один из примеров этого –микродомены Са2+, регулирующие миграцию фибробластов, в клетках линии Wi38. Эти мигрирующие фибробласты проявляют обратный градиент Са 2+, при этомнизкая концентрация Са2+ найдена по их переднему краю, где функционируютмногочисленные эффекторные белки, опосредующие миграцию, которые требуютповышенной концентрации Ca2+. Решение этой головоломки было найдено в Са2+микродоменах: по всей передней кромке клеток среди региона со сниженнойконцентрациейСа2+былинайденымикродоменыдостаточновысокойконцентрации Са2+ со средним диаметром всего 5.27 (±0.05) мкм и длительностьюот 10 мсек до 4 сек [375]. Кроме того, в нейронах приток Са2+ через один каналподтипа TRPC5 ингибирует дендритный рост, тогда как Са2+ приток через другойканал подтипа TRPC6 инициирует дендритный рост [518].Другаястратегия,используемаяклеткамидлядифференциальнойрегулировки Ca2+-зависимых событий – модуляция Ca2+ в виде волн с различнойчастотой, которая, в свою очередь, зависит от силы раздражающего стимула.Некоторые ферменты способны трансформировать информацию, закодированнуюв частоте Са2+ колебаний [521].

Например, в Т-клетках быстрые колебаниястимулировали один набор факторов транскрипции (NFAT и Oct/OAP) для36экспрессии IL-2, в то время как менее частые колебания активировали другойтранскрипционный фактор (NF -кВ) с экспрессией IL-8 [340]. Эта специфичностьвыражается в различной Са2+ чувствительности ряда сигнальных молекул итранскрипционных факторов [423]. Таким образом, данный агонист можетрегулировать различные клеточные функции посредством различных частотколебаний [427]. Кальмодулин (Cmd) при связывании четырех ионов Са2+ можетактивировать несколько эффекторов [423]. Один из важнейших среди них –Са2+/Cmd–зависимые киназы (CamK). Транскрипционный фактор NF-κB, какправило, удерживается в цитозоле посредством связи с его ингибиторами IκB,однако фосфорилирование IκB с участием CamK приводит к деградации этихкомплексов, позволяя NF-κB транслоцироваться в ядро и промоцироватьтранскрипцию генов [306].

Поскольку реаккумуляцияIκBосуществляетсямедленно (они должны быть ресинтезированы), низких частот Са2+-колебанийдостаточно, чтобы обеспечить транскрипцию NF-κB-регулируемых генов [338].Существует длинный и постоянно растущий список других транскрипционныхфакторов, регулируемых тем или иным подтипом CamK [325].общепризнанный Cmd эффектор - кальциневрин,Другойсерин/треонин фосфатаза,которая дефосфорилирует NFAT с последующей транслокацией его в ядро ирегуляцией транскрипции генов [341, 511].

Другие киназы внутри ядрарефосфорилируют NFAT, обусловливая его скорейшее возвращение в цитозоль[339]. Оптимальной для NFAT-опосредованной транскрипции является непостоянная концентрация Са2+, а повторяющиеся Са2+ - колебания в определенномдиапазоне частот. Этот диапазон может варьировать, так как определяетсясвойствами других участвующих кофакторов. Напротив, другие Са2+-зависимыеферменты с совершенно иными кинетическими свойствами будут лучшестимулироваться устойчивым повышением Са2+, чем периодическими Са2+осцилляциями [310, 547]. Частоты Са2+ осцилляций могут быть преобразованы нетолько киназами и фосфатазами, но и с помощью Са2+-зависимой протеазыкальпаина.

При активации Са2+ эта цистеиновая протеаза проявляет свое действиес помощью различных цитозольных и/или ядерных факторов [516]. S100 Са2+-37связывающие белки - низкомолекулярные белки с важными регуляторнымифункциями в буферизации кальция, регуляции киназ и фосфатаз, клеточнойпролиферации, дифференцировки, метаболизма энергии, цитоскелет-мембранныхвзаимодействий и воспаления.