Диссертация (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 2

Задержка или отсутствие индукции апоптоза фибробластов приводит кчрезмерному фиброгенезу [401, 501].Регуляция интенсивности апоптоза происходит с участием ядерногофактора транскрипции NF-kB. Активация NF-κB приводит к блокированиюпроцессов апоптоза, продлевая жизнь клеток-эффекторов в очаге воспаления[439].

Моноциты, макрофаги и дендритные клетки также оказывают влияние навоспаление и фиброз. Эти клетки регулируют активирование фибробластов и ихпредшественников через цитокин-зависимые и независимые пути, в том числе ичерез влияние на ядерный фактор транскрипции NF-kB, вызывая дополнительное9повреждение тканей и стимулируя устойчивость фибробластов к апоптозу [384,385, 439].Одним из ведущих мессенджеров, опосредующих большинство клеточныхсобытий, и принимающих активное участие в регуляции основной функциифибробластов – строительстве соединительной ткани, является кальций (Ca2+) [33,461].

Нарушения Ca2+ гомеостаза фибробластов сопровождаются изменениемжизнеспособности клеток, процессов пролиферации, синтеза белка, активациейфакторов транскрипции [333, 334, 496]. Многие факторы роста и цитокиныизменяют содержание Ca2+ в фибробластах [474]. Некоторые ферменты способнытрансформировать информацию, закодированную в частоте Са2+ колебаний [427,521]. Это приводит к активации факторов транскрипции с последующейрегуляцией транскрипции генов [306, 423, 534, 569]. Ключевое значениекальциевого гомеостаза для физиологического и патологического моделированияактивации и транскрипции генов, изменения интенсивности пролиферации,дифференцировки и гибели клеток – строителей соединительной ткани [333, 334]указывают на то, что лекарственные средства группы блокаторов медленныхкальциевых каналов (БМКК) могут быть инструментом воздействия нафибробласты и клетки их микроокружения при избыточном образованиизаместительнойсоединительнойткани.ОднакоиспользованиеБМККвклинической практике ограничивается их кардиогемодинамическими эффектами,нивелирующими их антифиброгенное действие.В последние годы в зарубежной литературе появился ряд сообщений,прямо или косвенно свидетельствующие о наличии у БМКК помимо основныхкардио-иреализуемыхангиодинамическихмодификациейэффектов,фармакологическихформирующейсясоединительнойэффектов,тканисподавлением формирования атеросклеротического поражения [317, 378, 413, 505],снижением коллаген-продуцирующую функции легочных фибробластов [423],наличием антифиброгеннный эффект при фиброзе печени [335], болезни Пейрони[311, 355], при контрактуре Дюпюитрена [449, 571], уменьшением образованияпослеоперационных эпидуральных и внутрисуставных спаек [442].

Появились10данные локального применения БМКК верапамила в клинике для леченияпатологических кожных рубцов [540, 554]. Авторы констатируют возможностьзначительного улучшения функциональных, морфологических и косметическихсвойств формирующегося кожного рубца инфильтративным пропитыванием еготолщи раствором верапамила. Однако выраженная болезненность процедурысущественно снижает ценность метода. Данные исследования по выявлениюновых свойств у известных, зарекомендовавших себя в медицинской практике,БМКК носят скорее констатирующий характер, то есть документируютэффективность БМКК в предотвращении чрезмерного фиброгенеза, но при этомне содержат сколько-нибудь аргументированного толкования механизмов ихдействия. Следует учитывать, что БМКК - большая и достаточно неоднородная похимическойструктурегруппалекарственныхсредств,включающаявысокоспецифичные в отношении медленных кальциевых каналов (производныефенилалкиламина,бензотиазепина,дигидропиридина)(производные прениламина, дифенилпиперазины)инеспецифичныепрепараты, существенноразличающиеся по фармакокинетическим параметрам и фармакологическимсвойствам.

Вероятно, что препараты разных групп БМКК обладают различнойактивностью в отношении регуляции формирующейся соединительной ткани.Данные о влияние различных препаратов БМКК на процессы фиброгенеза приспайко- и рубцовообразовании немногочисленны,противоречивы и требуютдальнейших исследований [317, 322, 360]. Выявление среди БМКК группылекарственных средств, обладающих наиболее выраженным фармакологическимэффектом имеет значение в разработке новых противорубцовых лекарственныхформ и их всестороннем исследовании при поиске новых методов лечения ипрофилактики, которые приостановили бы прогрессирование келоида и егорецидива.Все выше изложенное явилось основанием к проведению исследованийвлияния лекарственных средств группы блокаторов медленных кальциевыхканалов на формирование соединительной ткани в процессе спайко- ирубцовообразовании(отсозданияадекватнойэкспериментальноймодели11патологического процесса до выявления механизмов действия БМКК, сопределением наиболее эффективного среди них препарата, дозового режима испособов его введения), а также возможности использования вновь выявленныхсвойств у известных, зарекомендовавших себя в кардиологической практике,лекарственных средств БМКК для более рационального их применения, созданияновых лекарственных форм.Цель исследованияВыявить закономерности и особенности фармакодинамики блокаторовмедленныхкальциевыхсоединительнойтканиканаловпривкачествеспаечном процессерегулятороввбрюшнойобразованияполостииформировании патологических кожных рубцов.

Разработать оптимальный состави технологию оригинального антирубцового крема с верапамилом, обосноватьего эффективность и безопасность.Задачи исследования1.Для проведения фармакодинамических исследований на крысахи кроликах создать модель перитонеального спайкообразования, провестимониторингбрюшнойспаечного процесса и разрастания соединительной ткани вполостисопределениемфункциональнойактивностифибробластов и макрофагов.2.ИзучитьдозозависимоевлияниеБМККнифедипина,дилтиазема и верапамилана пролиферативную и анаболическуюактивностьфибробластовперитонеальныхимакрофаговкрыссиспользованием клеточных технологий.3.Исследовать экспрессию транскрипционного фактора NF-κB вперитонеальныхидермальныхфибробластахивлияниеБМКК12нифедипина, дилтиазема и верапамила намолекулярные механизмырегуляции активности разных типов фибробластов.4.Среди исследуемых БМКК определить наиболее эффективныйпрепарат дляпредотвращения избыточного фиброгенеза; обосноватьдозовый режим его внутрибрюшинного введения крысам, оптимальный дляпрофилактики образования спаек при минимальной выраженности илиотсутствии кардио- и гемодинамических эффектов5.Изучить влияние верапамила на распространенность спаечногопроцесса в брюшной полости крыс и кроликов, морфологическиехарактеристики спаек, биохимические показатели и цитокиновый профильперитонеальной жидкости.6.Разработать новую лекарственную форму – антирубцовый кремс верапамилом, обосновать выбор компонентов для противорубцовойкомпозиции,провести технологические исследования по разработкеоптимального состава крема.7.Экспериментально обосновать эффективность и безопасностьприменениеантирубцового крема с верапамилом для профилактики илечения патологических кожных рубцов.Научная новизна исследованияВпервыесиспользованиемкомплексногоиразноуровневого(молекулярный, клеточный и организменный уровень) подхода на адекватнойэкспериментальной модели образования спаек в брюшной полости (патент2260854 РФ), in vivo (крысы, кролики) и in vitro (первичная культураперитонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеумом и перевиваемойкультуре дермальных фибробластов человека, производства Axol Bioscience), атакже на модели формирования патологических рубцов кожи доказано наличие ушироко используемых в кардиологии лекарственных средств БМКК способностирегулировать избыточное образование соединительной ткани при перитонеальном13спайкообразованииипосттравматическомформированиикелоидныхигипертрофических рубцов.Показано, что моделирование гемоперитонеума приводит к образованию вбрюшнойполостиэкспериментальныхживотныхмножественныхсоединительнотканных спаек и вызывает как in vitro, так и in vivo повышение (всреднем 6 - 10 кратное) пролиферативной активности фибробластов, ихколлагенсинтетической функции, продукции гиалуроновой кислоты, усиливаетфункциональную активность макрофагов, увеличивая темпы их трансформациииз моноцитов, синтез провоспалительных цитокинов TNF- и IL-1.Изучение in vitro на первичных культурах перитонеальных фибробластовкрыс позволило установить факт прямого воздействия БМКК верапамила идилтиазема на морфофункциональное состояние фибробластов и макрофагов.Показано, что в основе предотвращения избыточного роста соединительной тканиверапамилом или дилтиаземом лежит снижение чрезмерной при гемоперитонеумепролиферативной активности фибробластов и макрофагов, активности ядерногофактора транскрипции NF-κB, приводящего к ингибированию процессовапоптоза, торможение продукции оксипролина и гиалуроновой кислоты,провоспалительных цитокинов.

Выявлена дозовая зависимость установленногоэффекта: наибольшей фармакологической активностью обладал верапамил вконцентрации 0,0001 мл-1. Нормализующий эффект верапамила оказался болеезначимым (в среднем на 35,5%, р<0,05), чем у дилтиазема в той же концентрации.Нифедипин фармакологической активности в отношении перитонеальныхфибробластов и макрофагов не демонстрировал.Впервые установлено, что независимо от типа культивируемых клеток(перитонеальные фибробласты крыс или дермальные фибробласты человека) поддействием БМКК происходят однотипные изменения молекулярных механизмових активации – ингибирование ядерного фактора транскрипции NF-κB.

Наличие уверапамила угнетающего влияния на NF-kB объясняет универсальность егоантипролиферативногодействиявотношениифибробластовсоединительнотканных образований различной локализации.всоставе14In vivo, в экспериментахпо изучению фармакодинамики верапамила,подтверждена доказанная in vitro, эффективность лекарственной модуляциифункцийперитонеальныхфибробластовиклетокихмикроокружения.Установлена оптимальная доза (0,1 мг/ кг массы тела) верапамила дляинтраперитонеального введения, оказывающая выраженный фармакологическийэффектвотношенииизбыточнойпродукциисоединительнойткани,пролиферативной и анаболической активности перитонеальных фибробластов имакрофагов и не вызывающая значимых изменений кардио- и гемодинамики.Патогенетически обоснована целесообразность использования верапамилакак средства профилактики и лечения спаечной болезни и патологическихкожных рубцов. Доказано регулирующее действие верапамила на функциюфибробластов иростсоединительной ткани путем влиянияна кальциевыйобмен, а также универсальность действия БМКК на молекулярные механизмырегуляции перитонеальных и дермальных фибробластов.Теоретическисозданияиэкспериментальнолекарственнойпрофилактикииформылеченияобосновыванаверапамилапатологическихнакожногокожныхцелесообразностьприменениярубцов.дляРазработанантирубцовый крем (патент 2290919 РФ), содержащий 0,25% раствор верапамила,ланолин и вазелин, димексид при определенном количественном соотношениикомпонентов, обоснованном теоретически и подтвержденном стендовымииспытаниями.

В технологических и биофармацевтических исследованиях былиобоснованы оптимальная концентрация верапамила и состав основы крема;проведена оценкаизбыточногоклинических,антирубцового крема в качестве средства предупрежденияфиброгенеза.Приэкспериментальномбиомикроскопическихиизученииморфологическихдинамикиизмененийвпатологических рубцах кожи установлена эффективность крема, содержащеговерапамил, при щадящем, безболезненном способе его применения. Полученныйвэкспериментеinvivoэффектсопровождалсяуменьшениемплощадипатологического кожного рубца, нормализацией его цвета, уменьшениемболезненности. Более раннее созревание рубца, близкого к физиологическому,15без признаков гипертрофии, при экспериментальном лечении разработаннымантирубцовымкремомбиомикроскопическихдоказаносиспользованиемметодов.Сиспользованиемморфологическихданногоиспособафармакологического воздействия удалось контролировать процесс избыточногорубцевания, добиться оптимальных морфологических, функциональных икосметических результатов.Теоретическая и практическая значимость работыРабота носит фундаментальный и прикладной характер.