Автореферат (Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium), страница 3

plantarum она не превышала 257мкг/мл, у штаммов вида L. brevis количество синтезируемой ГАМК было максимальным уштамма L. brevis 15f, способного синтезировать до 675 мкг/мл. Продукция ГАМК штаммами9B. adolescentis достигала значительно больших величин (до 5611 мкг/мл), но такжеварьировала в широких пределах. В целом, штаммы рода Bifidobacterium были болееэффективными продуцентами ГАМК, чем лактобациллы.Наличие генов gadB у штаммов лактобацилл и бифидобактерийУ штаммов тех видов, что были представлены в нашей коллекции значительнымчислом штаммов, методом полимеразой цепной реакции было определено присутствие генаgadB, кодирующиего фермент глутаматдекарбоксилазу и ответственного за синтез ГАМК.

Ниу одного из штаммов L. rhamnosus и L. casei из GenBank не было генов gadB; для этих видовмы не смогли сконструировать праймеры и не проверяли штаммы данных видов.Таблица 3. Наличие гена gadB у штаммов различных видов лактобацилл и бифидобактерий.Вид бактерийКоличество проверенных штаммовНаличие гена gadB по данным ПЦРL. fermentum249L.

plantarum3131L. brevis44B. adolescentis2121B. angulatum32B. dentium11В результате проведённых ПЦР, у всех ГАМК-продуцирующих штаммов, кромеB. angulatum 212, удалось амплифицировать ген gadB (Табл. 3). Возможно, это результатмутации в месте отжига праймера у данного штамма. Стоит отметить, что наличие гена невсегда совпадало со способностью синтезировать ГАМК, так как некоторые штаммыL. fermentum содержали ген gadB, но не были способны к синтезу ГАМК. Это может бытьследствиеммутациивгенеgadBилимутации/делециигенаgadC,кодирующемглютамат/ГАМК антипортер, ответственный за экспорт ГАМК из клетки.Характеристика синтеза ГАМК у 4-х штаммов бактерий, отобранных в качествепотенциальных пробиотиковДля подробных исследований были отобраны два штамма лактобацилл и два штаммабифидобактерий, которые предположительно могли быть использованы в будущем в качествепробиотиков.

Это – штаммы Lactobacillus plantarum 90sk, Lactobacillus brevis 15f, Bifidobacteriumangulatum GT102 и Bifidobacterium adolescentis 150. Отобранные штаммы синтезировалинаибольшое количество ГАМК для своего вида и характеризовались пробиотическимисвойствами (высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным штаммам,антиоксидантными свойствами), установленными ранее.Были изучены динамика синтеза ГАМК в среде MRS и влияние добавления кофакторафермента глутаматдекарбоксилазы, пиридокальфосфата, для четырёх отобранных штаммов.10Lactobacillus plantarum 90skLogчислаКОЕ/мл1210864200 8 32 56 88 136160184Lactobacillus brevis 15fmg/L250200150100500Log КОЕ/млC mg/LLog числаmg/LКОЕ/мл12800106008640042002000 12 24 36 48 72 96 120Время роста культуры в часахВремя роста культуры в часахBifidobacterium angulatum GT102LogчислаКОЕ/мл1210864200 12 24 36 48 72 96 120Bifidobacterium adolescentis 150LogчислаКОЕ/млg/L43Log КОЕ/мл21C g/L0g/L121086420543210012 24 36 48 58 72Время роста культуры в часахВремя роста культуры в часахРисунок 1.

Продукция ГАМК штаммами Lactobacillus plantarum 90sk, Lactobacillus brevis 15f,Bifidobacterium angulatum GT102 и Bifidobacterium adolescentis 150.Все исследованные штаммы начинали синтезировать ГАМК через 8 часов роста;количество ГАМК достигало максимум через 48 часов (бифидобактерии) и 90 часов(лактобациллы) (рис.1).Пиридоксаль-5-фосфат (витамин B6, PLP) является кофактором всех исследованныхглютаматдекарбоксилаз.Представляло интерес установить, насколько добавление PLPповышаетГАМКпродукциюучетырёхотобранныхштаммовлактобациллибифидобактерий.Продукция ГАМК,мкг/мл12009006003000Контроль безPLP024487296120Время внесения пиридоксальфосфата (0,5 мM) от момента засева культуры в часахРисунок 2. Влияние добавления кофактора пиридоксаль-5-фосфата (PLP) на синтез ГАМКштаммом L.

plantarum 90sk. Все культуры росли 144 часа.11Как видно из рисунка 2, добавление PLP при засеве культуры L. plantarum 90sk, т.е. напервой стадии роста (лаг-фазе), не приводило к увеличению количества ГАМК (201 мкг/мл) вкультуральной жидкости по сравнению с контролем без добавления PLP (207 мкг/мл).Добавление PLP на ранней стационарной фазе (24 ч.) стимулировало активность ферментанезначительно (260 мкг/мл). Максимальное увеличение (843 мкг/мл) ГАМК было достигнутопри добавлении PLP на поздней стационарной фазе (72 ч.).

Вероятно, при использованииданного штамма в качестве психобиотиков целесообразно включать в препарат пиридоксин.Что касается двух штаммов B. angulatum GT102, B. adolescentis 150, добавление PLP неоказало заметного влияния на синтез ГАМК. Вероятно, это связано с тем, что эти штаммыспособны синтезировать PLP. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК штаммовпоказал наличие генов pdxST, контролирующих de novo синтез витамина B6.

У штаммаL. brevis 15f добавление PLP также не влияло на синтез ГАМК, хотя генов, контролирующихсинтез витамина B6, штамм не имел. Можно предположить, что у штамма существуетпрочная связь апофермента с кофактором и глютаматдекарбоксилазе хватает минимальныхколичеств кофактора, присутствующих в среде роста.Характеристика генов, обусловливающих синтез ГАМКЦелью данного раздела являлась изучение структуры gad-локусов у 4-х исследуемыхштаммов. gad-гены видов L. plantarum, B.

adoslescentis и B. angulatum практическинеохарактеризованы в литературе. gad-оперон у вида L. brevis охарактеризован (Li et al., 2013),но представляло интерес сравнить его структуру у описанных штаммов и у отобранного намиштамма L. brevis 15f. Для этого ДНК штаммов, отобранных как потенциальные пробиотики,была секвенирована. Резуьтаты поиска генов, определяющих синтез ГАМК у данныхштаммов, предоставлены на рисунке 3 и в таблице 4.Рисунок 3.

Структурная организация gad-оперонов штаммов L. plantarum 90sk (A),L. brevis 15f (Б), B. angulatum GT102 (В) и B. adolescentis 150 (Г); gadB, генглутаматдекарбоксилазы B; gadA, ген глутаматдекарбоксилазы А; gadC, ген антипортераглутамат/ГАМК; gadR, транскрипционный регулятор; gts, ген глутамил тРНК синтетазы.12Как и у других штаммов L. brevis (De Biase and Pennacchietti, 2012), у L. brevis 15f былиидентифицированыген глутаматдекарбоксилазы A gadA, ген глутаматдекарбоксилазы BgadB, ген антипортера глутамат/ГАМК gadC,транскрипционный регулятор gadR и генглутамил тРНК синтетазы gts.Для B. angulatum GT102 и B.

adolescentis 150 можно предположить наличие оперона израсположенных рядом генов глютаматдекарбоксилазы и антипортера. У L. plantarum 90skрядом с gadB геном нет гена, соответствующего антипортеру; ген, чей белок имеет гомологиюс антипортером L. brevis (25%) и аннотируется как аминокислотный транспортер расположенв другом месте хромосомы и можно предположить, что именно он - антипортер, хотяокончательных доказательств пока нет (рис. 3). У всех 4-х штаммов мы нашли ген,кодирующий фермент глутаматдекарбоксилазу gadB и ген, кодирующий антипортер gadC, чтоговорит о важности этих генов для синтеза и транспорта ГАМК.Мы хотели выяснить отличаются ли отобранные нами штаммы лактобацилл ибифидобактерий по строению генов/белков gadB/С от описанных в других работах.

Для этогомы сравнили аминокислотный состав этих белков у наших штаммов и штаммов из GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Уникальные замены могут служить маркерами дляидентификации и типирования штаммов лактобацилл и бифидобактерий.Таблица4.Уникальныезаменываминокислотныхпоследовательностяхбелков,участвующих в синтезе и транспорте ГАМК, у L.

plantarum 90sk, L. brevis 15f,B. angulatum GT102 и B. adolescentis 150.ГенбелокgadГлутаматдекарбоксилазаgadCПредполагаемыйГлутамат/ГАМК антипортерКоличество выровненныхпоследовательностейL. plantarum 90sk8Уникальные аминокислотныезамены в белкеВеличинабелкаD /G470 ак6E /A479 ак3412L. brevis 15fE /G7I /V141V /I247gadCГлутамат/ГАМК антипортер4N /S266505 акG /S289V /I291A /S369Глутаматдекарбоксилаз AD /N386gadAT /M234480 акE /K437gadBГлутаматдекарбоксилаза В6A /V224469 ак13ГенКоличество выровненныхпоследовательностейB.

angulatum GT102белокУникальные аминокислотныезамены в белкеВеличинабелкаT /MgadB4ГлутаматдекарбоксилазаP /L3478 ак127I /M264V /I31gadCПредполагаемыйГлутамат/ГАМК антипортерR /H1713469 акM /V273R /K314B. adolescentis 150gadB6Отсутствуют451 ак6Отсутствуют470 акСравнительный анализ последовательностей аминокислот белков, участвующих всинтезе ГАМК, у L. plantarum 90sk, L.brevis 15f и B. angulatum GT102 и B. adolescentis 150 споследовательностями аминокислот у других штаммов тех же видов из GenBank показал, чтоисследованные белки штаммов L. plantarum 90sk, L. brevis 15f и B. angulatum GT102 содержатот 2-х до 11 уникальных замен.

Это свидетельствует об отличии штаммов Российскойпопуляции от имеющихся в GenBank. Что касается штамма B. adolescentis 150, мы не нашлиуникальных замен в исследованных белках. Результаты представлены в таблице 4.Изучение экспрессии генов глутаматдекарбоксилазы и глутамат/ГАМК антипортера уштамма L. plantarum 90skПредставляло интерес изучить условия, влияющие на экспрессию gad-геновкодирующих глутаматдекарбоксилазу (ген gadB) и глутамат/ГАМК антипортер (ген gadC).Для этих опытов выбрали штамм L. plantarum 90sk.

Была исследована экспрессия генов gadBgadBАgadC6122448Стадии роста культуры в часах2-ΔΔCT9630Относительнаяэкспрессия2-ΔΔCTи gadC на различных стадиях роста, при различных pH среды и при добавлении желчи.ОтносительнаяэкспрессияgadCГлутаматдекарбоксилазаПредполагаемыйГлутамат/ГАМК антипортер6420БgadBgadCpH=6,5pH=3,5pH=5MRS+0,1%желчиРисунок 4. А. Относительная экспрессия генов gadB и gadC на различных стадиях ростаL. plantarum 90sk (в качестве контрольного использован ген recA). Б. Влияние различныхусловий на экспрессию генов gadB и gadC L.

plantarum 90sk в стационарной фазе (24 часа)относительно гена recA. Выбранные условия и ндукции экспресии (pH 3,5; 5; 0,1% желчи) невлияли на жизнеспособность штамма. На графике изображена относительная экспрессия,пересчитанная методом ΔΔCT.14Транскрипционная активность гена gadB начинала увеличиваться (в 2 раза) вэкспоненциальной фазе роста. Максимальное увеличение экспрессии гена gadB относительноначальной экспоненциальной фазы (в 6-8 раз) было достигнуто в начале стационарной фазы.Ген gadB продолжал активно транскрибироваться и дальше в поздней стационарной фазероста; в этих условиях наблюдалось относительное увеличение экспрессии – в 5-6 раз.Экспрессия гена gadC, кодирующего антипортер, была максимальной в стационарной фазероста (двукратное увеличение).

Увеличения экспрессии этого гена в экспоненциальной фазене обнаружено.Понижение pH среды до 3,5 и 5 в стационарной фазе роста культуры стимулировалоэкспрессию гена gadB относительно контроля в 3 и 3,5 раза соответственно; экспрессия генаgadC увеличивалась в 3,5 и 3 раза. Влияния 0,1% желчи на экспрессию генов gadB и gadC неотмечено (рис. 4Б).Опыты по определению влияния штамма L.plantarum 90sk на крыс в условияххолодного шока.ДляпроверкипредполагаемогоэффектаГАМК-продуцирующегоштаммаL. plantarum 90sk на животных были проведены опыты на крысах линии Спрэг-Доули,подвергнутых холодовому шоку.

Штамм L. plantarum 90sk был выбран потому, что помимосинтеза ГАМК, он обладал оптимальными пробиотическими свойствами (антиоксидантнымисвойствами, антагонистической активностью по отношению к патогенным и условнопатогенным штаммам, устойчивостью к низким pH). В качестве штамма сравнения былвыбран пробиотический штамм L. rhamnosus GG, неспособный к синтезу ГАМК (рис.

5).Рисунок 5. Схема опыта по определению влияния штамма L. plantarum 90sk на крыс вусловиях холодового шока.15Пролактиннг/млГАМКмкМ/Л2,5182151,5129160,5300MRSL.rhamnosusGGL.plantarum90skMRSL.rhamnosusGGL.plantarum90skРисунок 6. Количество ГАМК и пролактина в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опыта.Уровень ГАМК в крови крыс, получавших ГАМК-продуцирующий штамм, былдостоверно выше по сравнению с двумя контрольными группами (MRS и L.