Автореферат диссертации (Физиолого-биохимические особенности АТФазной активности крови и молока у продуктивных животных с различными типами обмена веществ в постнатальном онтогенезе), страница 3

Кровь стабилизировали гепарином из расчета 4-6 единиц на 1мл крови.У цыплят-бройлеров кровь отбирали из вен шеи и из подкрыльцовойвены. Кровь стабилизировали средой Алсвера.Стабилизированную кровь в термосе со льдом (+40С) доставляли через20-30 мин в лабораторию, для последующего анализа.9Физиолого-биохимические особенности АТФазнойактивности крови, молока, мышечной ткани упродуктивных животных с различными типами обменавеществ в постнатальном онтогенезеУ крупного рогатого скотав эритроцитах и молокев зависимости от:возрастаколичества иразмеражировыхшариковпородыУ свинейв эритроцитах и молокев зависимости от:возрастастадиилактацииколичества иразмера жировыхшариковколичества иразмераэритроцитовконцентрациистрофантина-G,ионов Na+ и K+концентрациистрофантина-G,ионов Na+ и K+возрастастадиилактациисезонагодаУ птицв эритроцитах имышечной тканив зависимости от:кроссаконцентрацииионов Na+ и K+количества и размераэритроцитовМетоды исследованийБиохимическиеФизиологическиеСтатистическиеВнедрение результатов научных исследованийУчебный процесс:Московскаягосударственнаяакадемияветеринарноймедициныибиотехнологии им.

К.И. СкрябинаСельскохозяйственные предприятия разных формсобственности Курской и Белгородской области,Всероссийскийнаучно-исследовательскийитехнологический институт птицеводства РАСХН,Курскийнаучно-исследовательскийинститутагропромышленного производства РАСХНРис.1. Схема исследований10Отделение эритроцитов от плазмы проводили путем центрифугированияв рефрижераторной центрифуге (+4…100C) в течение 30 мин при 3000оборотах.

Эритроциты после отделения от плазмы двукратно отмывалифизиологическим раствором.Фрагменты скелетной мускулатуры брали у цыплят в количестве 2-5 г исразу же помещали в термос со льдом для транспортировки в лабораторию.2. Изучение активности АТФазных ферментных систем жировыхшариков крупного рогатого скота и свиней. Пробы молока у крупногорогатого скота отбирали пропорционально суточному удою, у свиней - послевнутривенного введения 10…12 ЕД окситоцина из каждой функционирующейдоли молочной железы.Физиолого-биохимические методы исследований. 1.

Физиологическоесостояние крупного рогатого скота, свиней и птиц, в зависимости от возраста(фаз постнатального онтогенеза) и генетического потенциала (порода, кросс)оценивали общепринятыми в клинической практике методами – определениетемпературы тела, частоты пульса и дыхательных движений в минуту, массытела (В.Ф. Лысов, 1977, 2004; А.И.

Кузнецов, 2003).2. Количество и размер эритроцитов в крови крупного рогатого скота исвиней определяли в электронном счетном аппарате «Целлоскоп» исканирующем проточном цитометре (СПЦ). Количество и размер жировыхшариков в молоке крупного рогатого скота и свиней определяли по методике Н.Н. Липатова (К.К.Горбатова, 2010).3. Выделение мембран эритроцитов крупного рогатого скота и свинейпроводили гемолизом эритроцитарной массы в 0,4 М трис НСl с осаждениеммембран центрифугированием при 15 000 об/мин (Dodge J.T., Mitchell C.,Hanahan. D.J., 1963).

Выделение цитоплазматических мембран эритроцитовцыплят бройлеров осуществляли методом 3-х кратного замораживанияоттаивания в растворе сахарозы (=1,176), содержащем 50 ммольл-1 трис-H2S04буфер (pH 7,4) с последующим центрифугированием в течение 30 мин при 1000об/мин (Ю.Г. Шкорбатов, В.Г.Шахбазов, 1982, 1992; J. Chauveau, Y. Moule, C.Rauiller, 1956; V.

Seligy, M. Miyagi, 1969).4. Выделение мембран жировых шариков из молока, предназначенногодля определения АТФазной активности, проводили по методике, описанной вработе В.Н.Кириленко (1989). Отобранное молоко центрифугировали при 3 000об/мин в течение 30 мин при температуре 30о С. Полученные сливкиподвергали четырехкратной отмывке в 0,05 М трис - HCl буфере, содержащем0,15 М NaCl и 0,25 М сахарозы (буфер А). Отмытые сливки нормализовали досодержания жира 35 % и вручную сбивали в масло. Полученную при этомпахту, подвергали четырехкратной отмывке в 0,05 М трис – HCl буфере (pH7,5), содержащем 0,09 М KCl (буфер Б). Отмытую пахту центрифугировали при105 000 об/мин в течение 60 мин при температуре 5 оС. Отмытые мембраныжировых шариков ресуспендировали в буфере Б до содержания 50 мг сухоймассы мембран в 1 мл суспензии и использовали для определения АТФазнойактивности.115.

АТФазную активность определяли методами: а) K.S. Keeton et al., 1972,в среде, содержащей 150 мМ NaCl; 5,0 мМ KCl; 25 мМ трис-HCl; рН – 8,0, 3мМ Na2АТФ, 3 мМ MgCl2; пробы инкубировали в течение 45 мин притемпературе 370С. При определении Mg2+-АТФазы, (оуабаиннечувствительной)в субстратную среду вводили 10-4 М оуабаина (строфантин-G); б) А.Т.Иващенко и др.,1981.

При этом активность Mg2+ - АТФазы определяли в 50 мМтрис-H2S04 буфере (pH 7,4) содержащем 60 мМ NaCl, 2 мМ АТФ и 2 мМ MgCl2.Активность Na+, K+ - АТФазы измеряли в той же среде, заменяя 15 мМ NaCl на15 мМ KCl. Ca2+-АТФазную активность определяли, внося в среду 510-4 MCaCl2. Уровень HCO3--АТФазной активности оценивали при замене 30 мМNaCl на 30 мМ NaHCO3.Активность АТФаз оценивали по приросту неорганического фосфатапосле инкубации и выражали в наномолях неорганического фосфата (Фн)отщепленного 1 мг белка в 1 мин.6. Неорганический фосфат определяли спектрофотометрическим методом(Кондрашова М.Н.

и др., 1965) при длине волны 390 нм, и по методу Чена(1957) в модификации А.М. Казеннова и соавт. (1984).7. Концентрацию белка в мембранном материале определяли методомLowry et al (1951) и методом Варбурга и Кристиана (Досон Р., 1991),экстинкцию измеряли при длине волны 260 и 280 нм.8. Белковые фракции молока оценивали методом ионно-обменнойхроматографии, на разработанную для этих целей лабораторную установкунами получен патент на полезную модель №131570 «Устройство дляионообменного разделения белковых фракций молока и их количественногоопределения» (Е.Ю.Федорова, В.В.Мосягин, В.И.Максимов, Ф.И.Василевич).9.

Полученные в ходе исследований данные подвергалисьбиометрической обработке (Э. Корниш-Боуден, 1983; С.Д. Варфоломеев, 1999;К. Дерффель,1994; К. Геккелер и др., 1994; В.И. Крутов, 1989, Н.Я. Макарова,В.Я. Трофимец, 2002, А.Н. Кутейников, 2008) на ПЭВМ с использованием MSExcel и STATISTICA 6,0.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1 Физиологические показатели у животных разных видов изакономерности их изменения с возрастомДля определения состояния как организма в целом, так и его отдельныхсистем важными являются физиологические показатели, такие как температуратела, частота пульса и частота дыхательных движений.

Данные параметрыобязательны при наблюдении за животными, они зависят от возрастаживотного и меняются в процессе онтогенеза.Как показали наши исследования, физиологические показатели крупногорогатого скота, свиней и цыплят-бройлеров на всех этапах развития находилисьв пределах нормы (В.Ф. Лысов, Т.В. Ипполитова, В.И. Максимов, Н.С.Шевелев, 2012). В процессе онтогенеза данные параметры также претерпеваютряд изменений, которые соотносятся с возрастными изменениями в организмеживотных и отражают определенную стадию их развития. Все полученные12данные позволяют сделать вывод о возможности использования изученныхгрупп животных для дальнейших исследований.3.2 АТФазная активность эритроцитов и молокакрупного рогатого скота и взаимосвязь с физиологическими ибиохимическими процессами в крови и молоке3.2.1 Активность АТФаз мембран эритроцитов крупного рогатогоскота черно-пестрой и симментальской породыВлияние возраста и ингибитора-строфантина-G на АТФазнуюактивность эритроцитов.

Отмечено достоверное (P<0,001) возрастноеснижение активности общей (Mg2+, Na+, K+-) АТФазы, Mg2+-АТФазы и Na+, K+АТФазы (метод Keeton, K.S., 1972) эритроцитов крупного рогатого скота чернопестрой и симментальской пород, что можно объяснить «увеличениеммикровязкости мембран эритроцитов при их старении» (Ли С.В. и др., 1982),«снижением в них количества АТФ на 20%» (Bartosz G., 1982). Так, в группекоров черно-пестрой породы наибольшее снижение наблюдается по активностиNa+, K+-АТФазы- 21,2 %, наименьшее- по активности Mg2+-АТФазы -11,9 %.

Вгруппе симментальских животных наибольшее возрастное снижениехарактерно для активности Mg2+-АТФазы- 17,49 %, наименьшее снижение -дляактивности Na+, K+-АТФазы -15,23 %, что подтверждается результатамикорреляционного анализа (таблица 2). Выявленная межпородная разница поактивности Mg2+, Na+, K+-, Mg2+-и Na+, K+-АТФазы недостоверна (P>0,05).Таблица 2. Результаты корреляционного и регрессионного анализа влияниявозраста крупного рогатого скота на АТФазную активность эритроцитовПоказательMg2+,Na+, K+Mg2+-АТФаза Na+, K+АТФазаАТФазаЧерно-пестрая породаКоэффициентвозрастной корреляции-0,755**-0,604**-0,555*Уравнение регрессииy=3,24-0,03xy=1,92-0,01xy=1,32-0,01xСимментальская породаКоэффициентвозрастной корреляции-0,695*-0,573*-0,314**Уравнение регрессииy=3,07-0,03xy=1,99-0,02xy=1,07-0,01x*- P<0,05; **- P<0,01Двухфакторный дисперсионный анализ, независимыми факторами прикотором служили возраст (фактор А) и наличие в среде инкубациистрофантина-G (фактор Б), показал, что возраст достоверно (Р<0,05)детерминирует активность общей АТФазы эритроцитов крупного рогатогоскота черно-пестрой и симментальской породы на 3,2% и 3,5% соответственно.Коэффициенты детерминации активности общей АТФазы строфантином-Gсоставили соответственно 92,8% и 90,5% (Р<0,05).Влияние концентрации ионов натрия и калия на АТФазнуюактивность эритроцитов.