Диссертация (Комплексная оценка морфофункциональных и микробиологических показателей половых клеток быков - производителей), страница 3

Усовершенствовать экспресс-метод идентификации аномальных формсперматозоидов.2. Оценить целостность акросомы спермопродукции, поступающей в РФ изза рубежа.3. Разработать методику подсчета индекса фрагментации ДНК-хроматинасперматозоида.4. Сконструировать лабораторные модели лазерных излучателей и разработать режимы облучения спермы, применяемые при ее сексировании.5. Установить морфофункциональные показатели и оплодотворяющую способность спермы после воздействия на нее лазерного излучения.6. Усовершенствовать методы выявления и идентификации возбудителейинфекционных болезней животных в импортируемой в РФ спермопродукции.7. Разработать молекулярно-генетические методы идентификации мутаций,ассоциированныхснаиболеераспространенныминаследственнымипатологиями крупного рогатого скота.8.

Разработать алгоритм оценки качества импортируемой спермы по мор-13фофункциональным, микробиологическим, генетическим и репродуктивнымпараметрам.Научная новизна.Разработан алгоритм комплексной оценки морфофункциональных имикробиологических показателей половых клеток быков-производителейМодифицирован метод идентификации сперматозоидов с использованиемкрасителя Farelli при клинических исследованиях биоматериала, позволяющийобъективно количественно оценивать морфологические особенности спермиевна целостность их акросомы. Установлено, что поступающая в РФ из-за рубежасперма, разделенная по полу, содержит патологические формы половых клеток(фрагментация ДНК в головке, отклонение от биомеханической оси движения,митохондриальная дисфункция), около 10% спермодоз из зарубежных страннесут аномальные гены, снижающие уровень оплодотворяемости коров, жизнеспособность молодняка.

Это приводит к эмбриональной смертности и абортам, авыделенные из 40% исследованных спермодоз микроорганизмы P.aueroginosa,E.coli, Mycoplama spp., Mycoplama bovigenetalium, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Ureaplasma diversum, Aspergillus niger, Aspergillus flavus могут представлять потенциальную биологическую опасность для животноводства РФ.Предложен экспресс-тест по определению структуры ДНК-хроматина дляанализа маркеров апоптоза половых клеток крупного рогатого скота и определены пороговые значения показателя его фрагментации как маркера фертильностисамцов - производителей.Научно обосновано и экспериментально подтверждено повреждающее действие лазерного облучения на сперматозоиды быков-производителей при получении сексированного семени и представлен детальный биофизический скрининг исследуемых образцов спермопроб, раскрывающий патоморфизм половыхклеток после воздействия лазерных лучей с учетом их длины волны и мощности.Представлены данные по фотосенсибилизирующему эффекту лазерному, флюрохромному и электромагнитному воздействию на половые клетки.Апробированы методологические подходы к микологической экспертизе14половых клеток животных-производителей, предназначенных для индикации иидентификации грибов.Разработаны параметры рабочих характеристик современных питательныхсред, предназначенных для выявления разных видов грибов с экспериментальноустановленными условиями инокуляции и культивирования.Научная новизна работы подтверждена Патентом № 2657609 от 14 июня2018 г.

«Способ определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей».Теоретическая и практическая значимость работы.На основании установленных морфофункциональных и микробиологических показателей гамет быков-производителей разработана концептуальная базао потенциальных рисках распространения инфекционных болезней, генетических аномалий и патологий органов репродуктивной системы крупного рогатогоскота.На основании результатов исследований в Межгосударственный стандарт –ГОСТ 26030–2015 «Средства воспроизводства.

Сперма быков замороженная.Технические условия» было внесено 18 поправок, которые нашли отражение вположениях нового ГОСТа 26030-2017 «Средства воспроизводства. Сперма замороженная. Технические условия».Разработанные молекулярно-генетические методы идентификации мутаций,ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиямикрупногорогатогоскота,позволиливыявитьвспермебыков-производителей, поступающей в РФ из-за рубежа, такие генетические аномалии,как брахиспинальный синдром, комплексный порок позвоночника, недостатокадгезии лейкоцитов, недостаток уридинмонофосфатсинтетазы, цитруллинемии,дефицит фактора свертывания XI, дефицит холестерина.Биологическая оценка спермопроб как отечественного, так и зарубежногопроизводства выявила случаи ее контаминации патогенными и условнопатогенными микроорганизмами: Pseudomonas aueroginosa, Ureaplasma diversum,Mucoplasma californicum, Mucoplasma bovigenitalium, E.

coli, Campilobacter spp.,15Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Mucorspp.Показано, что оценка репродуктивных параметров половых клеток позволяет увеличить процент выявляемости спермопродукции низкого качества, завозимую на территорию РФ по морфофункциональным и репродуктивным характеристикам.Результаты мониторинговых исследований явились базой для формирования комплекса нормативных документов по анализу репродуктивных параметров спермопроб по биологическим, микробиологическим и генетическим показателям, а также для разработки методических указаний и рекомендаций по ветеринарно-санитарному контролю генетического материала, которые былиутвержденные отделом обеспечения единства измерения ФГБУ «ВГНКИ»,одобрены на заседании ученого совета ФГБУ «ВГНКИ», на Секции «Зоотехнияи ветеринария» отделения сельскохозяйственных наук 28 августа 2017 года.Для определения качества генетического материала быков-производителейразработаны, прошли успешную метрологическую экспертизу и валидированыэкспертнойкомиссиейотделаобеспеченияединстваизмеренийФГБУ«ВГНКИ», а также утверждены на Секции «Зоотехния и ветеринария» отделениясельскохозяйственных наук РАН семь методических рекомендаций и два методических указания.Результаты проведенных исследований отражены в учебнике «Методологиянаучного исследования» (2017), рекомендованном ФУМО в системе высшегообразования по укрепленной группе специальностей и направлений подготовки.Научные данные, полученные в ходе выполнения работы, используются вучебном процессе в ФГОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И.

Скрябина, вФГБОУ РАМЖ, ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ.Методология и методы исследований.Материалом для количественных и качественных (морфологических, морфофункциональных, физико-химических, генетических, микробиологических и16др.) исследований являлась спермопродукция крупного рогатого скота разныхпород как отечественного, так и зарубежного происхождения, а также патогенные и условно-патогенные бактерии и грибы, выделенные из спермы племенныхбыков. В качестве лабораторных методов при исследовании спермопродукциииспользовали молекулярно-генетический, бактериологический, микологический,физические и химические методы.Использовали как общепринятые, сертифицированные методы, так и разработанные, и усовершенствованные нами в процессе проведения научных исследований.Степень достоверности.Результаты работы были получены при использовании утвержденных вустановленном порядке методов и ГОСТов, на сертифицированном оборудовании и определяются достаточным количеством проведенных исследований набольшой выборке животных.

Все образцы изучаемого генетического материалана всем протяжении проведения научных исследований имели одинаковый объем и концентрацию. Выборка биоматериалов являлась репрезентативной и достоверно отражала основные признаки генеральной совокупности изучаемыхобъектов.Микробиологические и генетические исследования спермопродукции былипроведены на базе лицензированных и аккредитованных лабораторий ФГБУ«Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».Цифровой материал был подвергнут статистической обработке по методикеЯковенко А.М. «Биометрические методы анализа качественных и количественных признаков в зоотехнии» (2013).Соответствие паспортам специальностей.По специальности 06.02.01 – Диагностика болезней и терапия животных,патология, онкология и морфология животных диссертационная работа выполнена в следующих областях исследований: вопросы клинической ветеринарии,принципы, методы и технологии обследования, частная синдроматика (репро-17дуктивные расстройства); особенности патоморфологических проявлений, ихзначение для диагностики; структура и функции клеток и тканей животных, взаимосвязь функциональных и структурныхизменений в норме и патологии;морфологические критерии оценки, обеспечивающие производство высококачественных продуктов животного происхождения.По специальности 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология,эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология диссертационная работа выполнена в следующих областях исследований: морфологические,биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий и грибов; генетика, культивирование бактерий и грибов; методы выделения микроорганизмов из патологического материала, средства и методы диагностики инфекционных болезней животных, индикация патогенных микроорганизмов; развитие исовершенствование ветеринарной службы страны, обеспечение, планирование иосуществление ветеринарных мероприятий при инфекционных болезнях животных.Работа соответствует паспортам специальностей 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных и06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микологияс микотоксикологией и иммунология.Апробация работы.Основные результаты проведенных исследований были доложены:На международных конгрессах:- 4th EAVLD Congress of the European Association of Veterinary laboratory Diagnosticians (Чехия, Прага, 2016) (Приложение 21, 22, 23).На международных конференциях:- международная научно-практическая конференция «Приоритеты ветеринарной науки и инновационный опыт» (Республика Азербайджан, Баку, 2016);- IV международная научная конференция «Достижения молодых ученых вветеринарную практику», посвященная 55-летию учреждения аспирантуры дляподготовки научных работников в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2016);18- международная научно-практическая конференция «Проблемы и перспективы развития современной репродуктивной технологии, криобиологии и ихроль в интенсификации животноводства» (Московская обл., пос.