Диссертация (Миниатюризация циклического инжекционного фотометрического и флуориметрического анализа), страница 9

Фрезерная технология остаетсянаиболее простой и доступной для изготовления мезофлюидных устройств изполимерных материалов.В рамках данного исследования была разработана топология мезофлюидногоустройства для миниатюризации циклического инжекционного фотометрическогоанализа (Рисунок 26), которая включает в себя вертикальное отверстие –реакционную емкость (1), предназначенную для образования аналитическойформы при перемешивании растворов пробы и реагентов потоком газа.Реакционная емкость сообщается с атмосферой с одной стороны (5), с другой – сканалом, изготовленным в виде меандра (2), форма которого позволяет разделить59газовую и водную фазы за счет турбулентности при прохождении раствора изреакционной емкости в оптический канал (3) (длина оптического пути 36 мм).Рисунок 26. Топология мезофлюидного устройства для миниатюризациициклического инжекционного фотометрического анализа: 1 – реакционнаяемкость; 2 – канал, выполненный в форме меандра; 3 – оптический канал; 4 – каналдля подачи растворов в реакционную емкость; 5 – отверстие, соединяющиереакционную емкость с атмосферой; 6 – отверстие для источника света; 7 – линза;8 – светодиод; 9 – спектрометр; 10 – канал для сброса растворов.Сдвухстороноптическогоканалавмезофлюидноеустройствоинтегрированы элементы системы детектирования.

В качестве источника светаиспользовали светодиод, обеспечивающий излучение необходимой длины волны.На сегодняшний день светодиоды являются универсальными и компактнымиустройствами для миниатюризации фотометрического анализа в широкомдиапазоне длин волн. Перед светодиодом размещали линзу шарообразной формыдля улучшения соотношения сигнал/шум и устранения эффекта рассеяния света. Вкачестве детектора использовали портативный спектрометр, оптоволоконныйкабель которого закреплялся у оптического канала. Портативный спектрометр60обеспечивает спектральное разрешение 0,1 нм, и возможность детектироватьаналитический сигнал в широком диапазоне длин волн.Cхема изготовления мезофлюидного устройства для миниатюризациициклического инжекционного фотометрического анализа представлена нарисунке 27. Для изготовления устройства использовали отполированные,оптически прозрачные пластины из ПММА.

Так, на первом этапе в программеCut2D ver. 1,6 создавался чертеж расположения основных каналов устройства. Припомощи автоматизированного станка KitMillRD 300/420 (Originalmind Co., Япония)на пластинке из ПММА размером 76×52×10 мм вырезали каналы (ширина 0,8 мм,глубина 0,8 мм) в соответствии с чертежом (Рисунок 27 А, Б). Выбор ширины иглубины каналов обосновывался технологией изготовления. При изготовленииканалов ширина и глубина которых ≤ 0,5 мм наблюдалось значительное стачиваниесверла, была необходима его замена в течение изготовления одного устройства.При использовании устройства с шириной и глубиной каналов более 1 мм неудавалось достичь значительного сокращения объемов растворов.Пластинку с вырезанными каналами склеивали с ровной поверхностьюидентичной пластинки из ПММА (76 × 52 × 10 мм), на которой отсутствоваликаналы (Рисунок 27 В).

После склеивания пластин (Рисунок 27 Г) в верхней гранипросверливали цилиндрическое отверстие (диаметр 5 мм, глубина 26,5 мм) сконическим окончанием – реакционную емкость на фрезеровочной установке(Hitachi Co. Ltd., Япония) (Рисунок 27 Д).

С двух сторон оптического канала вмезофлюидное устройство интегрировали элементы системы детектирования.Просверливали отверстие (диаметр 6 мм, глубина 10 мм) для интегрирования вустройство источника света (Рисунок 27 Е). На противоположной торцевой граниустройства закрепляли оптический кабель спектрометра (Рисунок 27 Е). В качествеисточника света использовали светодиод (LED 820-01AU, Roithner Laser Technik,Австрия), излучающий свет при длине волны 820 нм. Для обеспечения стабильнойработы диода использовали источник постоянного тока (6146, DC Instruments, Inc.,Япония). Перед светодиодом помещали линзу шарообразной формы диаметром0,5 мм (nR = 1,517) (BL-05, Edmund Optics, США) для улучшения соотношения61сигнал/шум и устранения эффекта рассеяния света.

В качестве детектораиспользовали спектрометр (Maya 2000 Pro, Ocean Optics, США), оптоволоконныйкабель которого был закреплен на устройстве. При помощи прилагаемого кспектрометру программного обеспечения регистрировали аналитический сигнал.Поверхность отверстия в ПММА-пластине для линзы и светодиода, а такжеторцевую поверхность в месте крепления оптического кабеля тщательнополировали.

Изготовленное мезофлюидное устройство помещали в черный чехол,который представлял собой куб с черными стенками.Рисунок 27. Схема изготовления мезофлюидного устройства для миниатюризациициклическогоинжекционногофотометрическогоанализа.А-Е–этапыизготовления мезофлюидного устройства.На разработанное мезофлюидное устройство ЦИА с фотометрическимдетектированием получен патент на полезную модель № 143826 (заявка №2013157800,датаприоритета26декабря2013г.,зарегистрировановГосударственном реестре полезных моделей Российской Федерации 01 июля 2014г.).62Аналитическиевозможностиизготовленногоустройствабылиподтверждены на примерах автоматизированного фотометрического определенияэпинефрина и цистеина по реакции с 18-молибдодифосфатом аммония (18-МФА).3.2. Проточное фотометрическое определение эпинефринаВ качестве фотометрических реагентов для экспрессного определениявосстановителей могут быть использованы гетерополикомплексы (ГПК), привосстановлении которых образуются интенсивно окрашенные стабильныепродукты.

Для определения эпинефрина была изучена возможность использованиянового реагента 18-молибдодифосфата аммония (18-МФА), который относится кклассу гетерополикомплексов структуры Доусона. Реакции ГПК структурыДоусона со многими восстановителями происходят быстрее по сравнению с ГПКструктурыКеггина.Впервыепродуктреакции,образующийсявходевосстановления 18-МФА был описан Н. Wu [152]. Восстановленная форма 18МФА образуется быстро в ходе окислительно-восстановительной реакции и имеетсостав (P2MoVI16MoV2O62)8-, при этом происходит изменение цвета раствора.Исходный реагент 18-МФА окрашен в желтый цвет, в то время как, продуктокислительно-восстановительнойреакции–восстановленнаяформа(P2Mo16VIMo2VO62)8-, интенсивного синего цвета.

Известно применение 18-МФА вкачестве фотометрического реагента для определения восстановителей, таких какаскорбиновая кислота и п-аминофенол [153, 154]. В данной работе впервыеисследовали возможность применения 18-МФА для определения эпинефрина.Для установления стехиометрии фотометрической реакции с эпинефрином вработе использовали метод молярных отношений и метод изомолярных серий(Рисунок 28). В обоих случаях была обнаружена только одна точка пересечениякривыхнасыщенияприсоотношении18-МФА:эпинефрин=2:1.Значенияоптической плотности оставались постоянными даже при большом избыткеэпинефрина при рН<8.

Такая стехиометрия реакции соответствует общепринятому63механизму окисления эпинефрина [155], по которому продукт окисленияэпинефрина – адренохром.Рисунок 28. Стехиометрия фотометрической реакции 18-МФА с эпинефрином.Метод молярных отношений (а). Метод изомолярный серий (б).Наоснованииполученныхрезультатовбылпредложенмеханизмобразования восстановленной формы 18-МФА (P2Mo16VIMo2VO62)8-:В спектре поглощения наблюдается максимум оптической плотности придлиневолны820нм,чтоподтверждаетобразованиевосстановленнойдвухэлектронной формы (Рисунок 29). Молярный коэффициент светопоглощениясоставил 2,2∙104 л∙моль-1∙см-1.

Величина полученного молярного коэффициентасветопоглощениякоэффициентыдляэпинефринапоглощения,значительнополученныепопревышаетизвестныммолярныеметодикамегоопределения: 4,05 103 л∙моль-1∙см-1 при электрохимическом окислении на золотомэлектроде [156], 910 л∙моль-1∙см-1 по реакции с Fe(II) в среде аминоацетатнокарбонатного буферного раствора pH 8.3 [120].640,6Оптическая плотность0,50,40,30,20,10,050060070080090010001100Длина волны () нмРисунок 29. Спектр поглощения восстановленной формы 18-МФА, образующейсяпо реакции восстановления 18-МФА эпинефрином (С (эпинефрин)= 0,1 мМ, С (18МФА) = 0,2 мМ; рН=7,0; λ = 820 нм; l = 10 мм).Полнота протекания и скорость реакции между 18-МФА и эпинефрином взначительной степени зависит от рН раствора (Рисунок 30).

Кислотность средыконтролировали при помощи рН-метра и изменяли с помощью 0,5 М гидроксидааммония и 0,5 М раствора соляной кислоты в диапазоне рН от 4 до 10. Полученныерастворы перемешивали в течение 5 минут, помещали в кювету (длина оптическогопути 10 мм) и измеряли оптическую плотность полученного раствора относительнораствора сравнения при длине волны 820 нм.Рисунок 30. Зависимость оптической плотности восстановленной формы 18-МФА,образующейся по реакции с эпинефрином от рН раствора (С (эпинефрин)= 0,1 мМ,С (18-МФА) = 0,2 мМ; λ = 820 нм; l = 10 мм).65Как видно из полученных данных, представленных на рисунке 29,максимальные значения оптических плотностей фотометрируемых растворовнаблюдаются в диапазоне рН от 6,5 до 7,5.

При рН≥4,0 окислительновосстановительныйпотенциалпары18-МФА/(P2Mo16VIMo2VO62)8-остаетсяпостоянным и равным 0,57 В [157]. В то же время, окислительновосстановительный потенциал пары эпинефрин/адренохром снижается с ростомрН. Начиная с рН=6,5 восстановительная сила эпинефрина возрастает и реакция с18-МФА протекает до конца. При рН<6,5 наблюдается снижение скоростивосстановления 18-МФА. При значениях рН ≥7,5 степень гидролиза исходнойформы реагента 18-МФА заметно увеличивается и значения оптическихплотностей снижаются.Далеебылоизученоизменениеоптическихплотностейрастворавосстановленной формы 18-МФА во времени в указанном диапазоне рН (Рисунок30).

Было установлено, что что в интервале рН от 5,5 до 7 (Рисунок 31, кривые 1, 2,3) наблюдается незначительный рост величины оптической плотности во времени,тогда как при рН больше 7 происходит постепенное разрушение аналитическойформы (Рисунок 31, кривая 4). Для дальнейших экспериментов выбрали рН=7,0,обеспечивающий максимально быстрое образование аналитической формы истабильность образующейся восстановленной формы 18-МФА течение 30 минут.Рисунок 31. Зависимость оптической плотности восстановленной формы 18-МФА,образующейся по реакции с эпинефрином от времени при различных значениях рНраствора (С (эпинефрин)= 0,1 мМ, С (18-МФА) = 0,2 мМ; λ = 820 нм; l = 10 мм).66На следующем этапе проводили выбор оптимальной концентрациифотометрического реагента 18-МФА. Для этого в мерные колбы объемом 25 млпомещали 5 мл 0,1 мМ раствора эпинефрина, 5 мл фосфатного буферного растворарН=7,0, 5 мл раствора 18-МФА (концентрация от 0,05 до 0,6 мМ) и доводили дообъема 25 мл дистиллированной водой.