Автореферат (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 3

* - неспецифичный сигнал.9Рисунок 4. Мутантные белки Sup35 M1 иSup35-M2 могут входить в составагрегатов Sup35p. Белки из лизатов штаммов[PSI+], содержащих Sup35-HAp в сочетании сSup35-M1p или Sup35-M2p, были разделены спомощью модифицированного SDS-PAGE.Одним из возможных объяснений потери приона [PSI+] в присутствии sup35-M1или sup35-M2 могла быть неспособность соответствующих белков претерпеватьприонный переход. Для проверки этого предположения были сконструированыплазмиды, в которых эти мутации находились под контролем индуцибельногогалактозного промотора. Штаммы [psi-][PIN+], трансформированные этимконструкциями, приобретали нонсенс-супрессорный фенотип после роста на среде сгалактозой.

Это подтвердило, что исследуемые мутации могут индуцироватьпоявление приона, а потеря фактора [PSI+] в присутствии мутаций sup35-M1 иsup35- M2 не связана с неспособностью этих аллелей поддерживать прион.Для более детального исследования молекулярных механизмов элиминацииприона под действием sup35-M1 и sup35-M2 мы проследили динамику потери [PSI+]во времени. В присутствии мутации sup35-M1 не удалось обнаружить дестабилизацииприона. Потерю [PSI+] в клетках SUP35/sup35-M2 наблюдали только в ходе первых 20клеточных делений. Затем доля клеток с прионом стабилизировалась на уровнепримерно 30 % (Рис.

5А), и такое соотношение сохранялось вплоть до 50 поколения.Клоны, сохранившие прион несмотря на присутствие sup35-M2, имели одинаковуюскорость роста на среде без аденина, но немного отличались по размерам агрегатовSup35p (Рис. 5Б).А.Б.Рисунок 5. Дестабилизация [PSI+] в присутствии sup35-M2 зависит от количестваклеточных делений. (А) Зависимость доли клеток с прионом от количества клеточных деленийв присутствии мутаций sup35-M1 (М1) или sup35-M2 (М2), а также 4 мМ ГГХ (использовали вкачестве контроля). (Б) Результаты SDD-AGE лизатов, полученных из штаммов с SUP35,которые содержали sup35-M2, в течение более чем 50 клеточных делений.

В качестве маркерамолекулярного веса использован тироглобулин (670 кДа).Штаммы [PSI+], несущие только аллели sup35-M4 или sup35-M5, отличаются отконтрольного варианта по своему фенотипу (Рис. 2). С помощью специальнойтест-системы на основе конструкций с β-галактозидазой осуществили10количественную оценку эффективности нонсенc-супрессии. Для каждого из штаммовизмеряли активность β-галактозидазы и рассчитывали относительную эффективностьнонсенс-супрессии. Мы обнаружили значимое увеличение этого параметра в штаммах[PSI+] с sup35-M4 по сравнению с контрольным вариантом (штамм [PSI+] с SUP35)(Рис.

6). Важно отметить, что эти отличия сохранились и после замены мутацииsup35-M4 на аллель дикого типа. Штаммы [PSI+] и [psi-] также достоверно отличалисьдруг от друга по этому параметру. В использованной системе мы не зафиксировалидостоверного снижения частоты прочтения стоп-кодонов в штамме [PSI+] с мутациейsup35-M5 (Рис. 6).Рисунок 6. Аллель sup35-M4 приводит к формированию нового варианта приона с болеесильной нонсенс-супрессией. Приведены результаты оценки относительной эффективностипрочтения стоп-кодонов в штаммах, несущих мутантные аллели SUP35, или их производных.Достоверные отличия от штамма [PSI+] с геном дикого типа (либо до, либо после заменыплазмид) отмечены «*» (* – p < 0,05, ** – p < 0,01; критерий Манна-Уитни). WT → WT и M4 →WT — штаммы [PSI+], в которых соответствующую аллель SUP35 (WT или М4) заменили на гендикого типа.Эффективность нонсенс-супрессии в присутствии [PSI+] зависит от количествамономерного Sup35p, что во многом связано с количеством пропагонов в клетке(Tanaka et al., 2006).

Мы обнаружили, что только в клетках с sup35-M5 количествопропагонов достоверно меньше по сравнению с штаммом [PSI+], несущим аллельдикого типа (Рис. 7). Этот факт хорошо согласуется с ослаблением нонсенссупрессорного фенотипа этого штамма (Рис. 2).11Рисунок 7. Аллель sup35-M5 приводит к уменьшению числа пропагонов на клетку.Представлено среднее значение количества пропагонов в клетке для штаммов, несущихмутантную аллель, либо их производных. На графиках отложены среднеквадратичныеотклонения.

Достоверные отличия от штамма [PSI+] с аллелью дикого типа отмечены «*»( p < 0,05; критерий Манна-Уитни).2. Изучение влияния комбинаций мутантных аллелей sup35KK настабильность приона [PSI+]Для изучения эффектов комбинаций аллелей sup35KK использовали штаммы [PSI+],несущие аллели sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5, так как они могли поддерживатьприон. Эти штаммы трансформировали серией плазмид pRSU2, несущих аллелиsup35-M1 — sup35-M5. У полученных трансформантов проверяли способность растина среде без аденина. Для каждой из комбинаций аллелей было проверено по 16трансформантов (Табл.

2). Мутантная аллель sup35-M2 во всех случаях приводила кдестабилизации приона. Такой же эффект был обнаружен для сочетаний sup35-M4 сsup35-M3, или sup35-M4 с sup35-M5, но только у половины трансформантов (Табл. 2).Все остальные комбинации мутаций sup35KK не приводили к дестабилизации приона.Таблица 2. Дестабилизация приона [PSI+] при сочетании sup35-M2 или sup35-M4 с другимиаллелями. Указано количество трансформантов с нестабильным [PSI+]Аллель, поддерживающая прионВносимая аллельsup35-M3sup35-M4sup35-M5sup35-M1000sup35-M2161516sup35-M3000sup35-M4908sup35-M5000123.

Проверка влияния мутантных аллелей sup35KK на различные вариантыприона [PSI+]Эффекты мутаций, влияющих на стабильность [PSI+], зачастую являютсявариант-специфичными (Derkatch et al., 1999; King, 2001; Lin et al., 2011). В связи сэтим мы сравнили влияние мутаций sup35KK на стабильность различных вариантовприона. Для этой части работы были выбраны штаммы дрожжей, несущие вариантыприона, отличающиеся от варианта, ранее использованного в работе. Эти штаммытрансформировали плазмидами pRSU1, несущими различные аллели sup35KK.

Дляпроверки нонсенс-супрессорного фенотипа полученных трансформантов переносилина среду ¼ YEPD. Влияние мутаций sup35KK на стабильность приона в большойстепени зависело от варианта [PSI+]. При этом какой-либо корреляции выявить неудалось.4. Проверка эффектов мутантных аллелей sup35KK в зависимости отприсутствия приона [PIN+]Для того, чтобы проверить, могут ли описанные эффекты мутаций sup35KK бытьопосредованы присутствием фактора [PIN+], мы получили производные [PSI+] и [psi-]штаммов с делецией гена RNQ1.

У производных этих штаммов, несущих мутацииsup35KK, проверяли наличие нонсенс-супрессорного фенотипа. Мы не обнаружилиотличий в эффектах исследуемых мутаций между клетками [PIN+] и [pin-], это говорито том, что влияние sup35KK на свойства приона [PSI+] не связано с наличием [PIN+].5. Характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitroДля получения фибрилл, образованных различными вариантами Sup35NMp,соответствующий белок, слитый с шестью остатками гистидина в C-концевой частибелка, очищали из клеток E.

coli в денатурирующих условиях. В ходе экспериментабелок разводили как минимум в 100 раз в 5мМ фосфатном буфере (pH 7,4) c 150 мМNaCl до конечной концентрации в 5 мкМ. Полученный раствор инкубировали при25оС и аккуратном перемешивании. Процесс образования агрегатов Sup35NMpотслеживали по уменьшению количества мономерного белка с помощью SDS-PAGE.Исследование морфологии агрегатов Sup35NMpпроводили с помощьюпросвечивающей электронной микроскопии (микроскоп JEM Jeol-2100 на базересурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ).

Вовсех случаях нам удалось обнаружить фибриллы, образованные Sup35NMp. Затем мысравнили их линейные характеристики: длину и ширину. Оба этих параметраизмеряли по микрофотографиям в программе ImageJ. Результаты сравнения шириныфибрилл, образованных мутантными белками, продемонстрировали, что все онидостоверно шире контрольного варианта (белка дикого типа) (Рис. 8). Это доказывает,что исследуемые мутации действительно оказывают влияние на структуру агрегатовSup35p. Фибриллы Sup35NM-M1p и Sup35NM-M2p короче по сравнению сSup35NMp, в тоже время белок Sup35NM-M4p образует более длинные фибриллы(Рис. 8)13А.Б.Рисунок 8.

Сравнение линейных характеристик фибрилл, образованных различнымивариантами Sup35NMp. Представлены распределения по ширине (А) и длине (Б) фибрилл,образованных различными вариантами Sup35NMp. Достоверные отличия по сравнению с белкомдикого типа отмечены «*» ( * – p < 0,05,*** – p < 0,001; критерий Манна-Уитни).Прямоугольниками на графике ограничены значения, попадающие между первым и третьимквартилями распределения, линия в середине — медиана распределения.

Концы «усов» — краястатистически значимой выборки (без выбросов). Выбросы отмечены кружками.14ОБСУЖДЕНИЕВ ходе работы мы описали эффекты пяти мутаций, которые содержат двойныезамены соседних полярных незаряженных аминокислотных остатков на заряженные.Каждая из мутаций локализуется в одном из пяти олигопептидных повторов N-доменаSup35p. Разработанная система аллелей позволила нам выделить фрагмент белка,вовлеченный в формирование суперскладчатой β-структуры. Мутации, такие какsup35KK, в этом регионе приводят к дестабилизации всей структуры и потере фактора[PSI+].

Две из исследованных нами мутаций, sup35-M1 и sup35-M2, обладают такимэффектом при замене аллели SUP35 дикого типа на sup35KK (Рис. 2). Остальные тримутации способны поддерживать прион, но в разной степени меняют его свойства.Мы предположили, что для варианта [PSI+], исследованного в ходе работы,C-терминальная граница участка, необходимого для поддержания суперскладчатой βструктуры, локализуется между 63 и 69 аминокислотными остатками Sup35p.Обнаруженные эффекты мутаций sup35KK не связаны с изменением стабильностисоответствующего белка или с их собственным фенотипическим проявлением. Потеряприона в присутствии sup35-M1 и sup35-M2 не связана с неспособностью этихаллелей индуцировать [PSI+]. Кроме этого, мутантные белки могут образовыватьагрегаты in vitro. Все эти факты свидетельствуют о том, что эффекты мутацийsup35- M1 и sup35-M2 связаны именно с их влиянием на структуру агрегатов,результатом которого является потеря [PSI+].Факторы [PSI+] и [PIN+] связаны друг с другом.