Автореферат (1145905), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Прион [PIN+] необходим дляпоявления [PSI+] de novo (Derkatch et al., 1997), а точечные мутации или делеции в генеRNQ1 оказывают влияние на поддержание [PSI+] (Kurahashi et al., 2009, 2011).Поэтому можно было ожидать, что эффекты sup35KK будут зависеть от присутствия[PIN+], однако подобных закономерностей обнаружено не было.Важно отметить, что все описанные эффекты sup35KK характерны для конкретноговарианта [PSI+]. При исследовании других штаммов приона мы обнаружили, чтополученные нами мутации оказывают различное влияние на свойства различныхвариантов [PSI+].
Это закономерно, поскольку варианты [PSI+] отличаются поструктурной организации агрегатов Sup35p (Toyama et al., 2007; Chang et al., 2008).Известно, что многие мутации в SUP35, влияющие на стабильность [PSI+], являются«вариант-специфичными» (Derkatch et al., 1999; King, 2001).1. Влияние мутаций sup35-M1 и sup35-M2 на стабильность [PSI+]Полученные данные позволяют предположить несколько причин потери приона[PSI+] в присутствии мутаций sup35KK. Эти предположения основываются на отличияхв эффектах мутаций sup35-M1 и sup35-M2.
Из них только мутация sup35-M2дестабилизирует прион в присутствии копии гена дикого типа (Рис. 1). С другойстороны, обе эти мутации не могут поддерживать исследованный вариант [PSI+](Рис. 2). Об исчезновении приона в этих случаях свидетельствуют необратимая утратанонсенс-супрессорного фенотипа, которая сохраняется даже после замены мутантнойаллели на ген SUP35 дикого типа (Рис.
2), а также отсутствие агрегатов Sup35p(Рис. 3).Исчезновение [PSI+] под действием sup35-M1, судя по всему, вызванонеспособностью Sup35-M1p формировать гомоагрегаты, но это характерно только дляисследованного варианта приона. В пользу этой гипотезы говорит отсутствие влияниямутации на стабильность [PSI+] в присутствии аллели дикого типа (Рис. 1), а также то,что при этом Sup35-M1p включается в агрегаты белка дикого типа (Рис. 4). Мы15считаем, что sup35-M1 поддерживает прион в присутствии SUP35 только потому, чтов составе гетероагрегата молекулы Sup35-M1p чередуются с Sup35p.
Иными словами,Sup35-M1p может коагрегировать с Sup35p дикого типа, но не с таким же мутантнымбелком Sup35-M1 (Рис. 9).Рисунок 9. Влияние мутаций sup35KK на свойства приона [PSI+].Мутация sup35-M2 не может поддерживать исследованный вариант [PSI+] (Рис. 3)и приводит к дестабилизации приона даже в гетерозиготном состоянии (Рис. 1).Потеря приона при сочетании sup35-M2 и SUP35 неполная и составляет порядка 70 %,а эффективность этого процесса зависит от количества клеточных делений (Рис. 5А).Это не связано с ослаблением [PSI+], поскольку сохранившиеся варианты приона неотличаются по силе нонсенс-супрессорного фенотипа.
Мы предполагаем, что толькочасть прион-формирующего участка Sup35-M2p может связываться с агрегатами белкадикого типа и изменять суперскладчатую β-структуру. Следующая молекула, котораяприсоединится к такому гетероагрегату, копирует это изменение. Свидетельства такихмодификаций удалось выявить при сравнении размеров агрегатов среди клеток [PSI+],которые потеряли плазмиду с sup35-M2 (Рис. 5Б). Вероятно, в большинстве случаевэто приводит к формированию ненаследуемых амилоидов, что и приводит кисчезновению приона.2.
Влияние мутаций sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 на свойства приона [PSI+]Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 не приводят к потере [PSI+] (Рис. 2). Этопозволяет предположить, что соответствующие аминокислотные замены расположеныза пределами региона, необходимого для поддержания суперскладчатой β-структуры.Тем не менее, в их присутствии свойства [PSI+] изменяются. Мутации sup35-M4 иsup35-M5 меняют нонсенс-супрессорный фенотип, вызванный прионом [PSI+].
Штамм[PSI+], несущий sup35-M4, лучше растет на среде без аденина по сравнению с дикимтипом, а штамм с sup35-M5, наоборот, хуже (Рис. 2). Различия в уровне нонсенссупрессии в присутствии sup35-M4 также подтверждаются при использованииспециализированных методов количественной оценки, в частности, измерения16активности β-галактозидазы (Рис. 6). Мы предположили, что эти две мутацииприводят к формированию новых вариантов [PSI+]. Кроме этого, усиление приона вприсутствии sup35-M4 сохраняется даже после замены мутантной аллели на SUP35(Рис.
2,6). В то же время вариант [PSI+], который сохранился в присутствии мутацииsup35-M5, отличается от остальных по способности передаваться на аллель SUP35дикого типа, он теряется при замене мутации на SUP35 (Рис. 2).Количество пропагонов во многом определяет эффективность агрегации Sup35p вклетке [PSI+], это отражается и на уровне нонсенс-супрессии (Kryndushkin et al., 2003;Tanaka et al., 2006). Среди исследованных нами вариантов [PSI+] этот параметр былснижен только в клетках с мутацией sup35-M5 (Рис. 7). Этот факт позволяетпредположить, что шапероны клетки, в частности Hsp104p, хуже разрезают агрегатыSup35-M5p, поэтому новые пропагоны образуются реже. Важно также отметить, что вприсутствии sup35-M4 количество пропагонов не отличается от штамма с аллельюдикого типа (Рис.
7). Поэтому мы считаем, что усиление нонсенс-супрессорногофенотипа в случае этой мутации скорее связано с изменением скорости агрегацииSup35p.По длине фибрилл, образованных in vitro, мы также смогли косвенно оценитьскорость агрегации мутантных белков, поскольку в этой системе этот процесс ничемне ограничен.
Агрегаты Sup35NM-M4p значительно превосходят по длинеконтрольный вариант (Sup35NMp) (Рис. 8Б). Исходя из перечисленных результатов,мы считаем, что Sup35-M4p формирует фибриллы, которые с большей скоростьюприсоединяют мономерный белок.Мутации sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5 локализуются за пределами участка,необходимого для поддержания суперскладчатой β-структуры, однако оказываютвлияние на свойства приона и, вероятно, приводят к возникновению новых вариантов[PSI+]. В экспериментах in vitro нам удалось зафиксировать различия в структурефибрилл, образованных мутантными белками Sup35NM, от агрегатов белка дикоготипа: все они были шире (Рис.
8А). Рассматриваемые мутации sup35KK изменяютукладку белковых молекул в составе агрегатов Sup35p, но не дестабилизируютструктуру в целом (Рис. 9).3. Влияние комбинаций мутаций sup35KK на стабильность приона [PSI+]Сконструированныенамимутацииsup35KK,согласнотеоретическимпредпосылкам, оказывают влияние на стабильность приона [PSI+] только если онинаходятся в регионе, образующем суперскладчатую β-структуру. Мутации sup35-M1,sup35-M2, а также sup35-M4 оказывают влияние на стабильность приона [PSI+] самипо себе, или в сочетании с другими аллелями sup35KK. Таким образом, мыпредполагаем, что в прионных агрегатах белка дикого типа, характерных дляисследованного варианта приона, соответствующие повторы участвуют в образованиисуперскладчатой β-структуры.
При этом только первые два олигопептидных повторавходят в состав региона, необходимого для поддержания суперскладчатойβ-структуры, поскольку только sup35-M1 и sup35-M2 сами по себе приводят к потере[PSI+]. Четвертый повтор может участвовать в формировании β-структуры, но неявляется необходимым для ее поддержания, поскольку мутация sup35-M4 сама по себене приводит к потере фактора [PSI+] и дестабилизирует прион только в сочетании сдругими аллелями. Также необходимо уточнить, что в данном случае мы говорим оконформации белка дикого типа, характерной для исходного варианта [PSI+], доизменения его свойств под влиянием аллелей sup35KK (Рис.
10). Мутация sup35-M3 не17имеет каких-либо эффектов, даже при сочетании с другими аллелями sup35KK.Поэтому, следуя той же логике, мы предполагаем, что третий повтор не вовлечен вформирование суперскладчатой β-структуры.Рисунок 10. Возможные схемы организации β-слоев в исследованных прионныхагрегатах. OR – олигопептидные повторы N-домена Sup35p. Стрелками обозначеныповторы, предположительно формирующие β-слои.Внесение аллели sup35-M4 в штаммы [PSI+] с sup35-M3 или sup35-M5 приводит кдестабилизации приона (Табл. 2). Эта же мутация усиливает прион,поддерживающийся в присутствии SUP35 дикого типа. Согласно данным литературыданным, сильные варианты приона [PSI+] характеризуются менее протяженнойβ-структурой (Toyama et al., 2007; Chang et al., 2008). Совокупность этих фактовпозволяет нам предположить, что четвертый повтор мутантного белка Sup35-M4 неможет участвовать в образовании β-структуры (Рис. 10).
Это влечет за собойукорочение фрагмента белка, вовлеченного в формирование супер-складчатойβ-структуры, и усиление приона.4. ЗаключениеВ ходе работы мы описали влияние аллелей sup35KK на свойства [PSI+] и выявиликонкретные молекулярные механизмы, лежащие в основе соответствующих эффектов.В зависимости от своего положения мутации приводят либо к потере приона, либо кформированию его новых вариантов.
Аминокислотные замены в Sup35-M3p по нашимданным локализованы за пределами региона, участвующего в формированиисупер-складчатой β-структуры, поэтому соответствующая аллель имеет минимальноевлияние на свойства [PSI+]. Белок Sup35-M1 не может образовывать гомоагрегаты наоснове исследованного варианта приона, и в этом случае [PSI+] сохраняется толькоблагодаря присутствию аллели SUP35 дикого типа. Включение белка Sup35-M2 вагрегаты Sup35p приводит к изменению их структуры, что в большинстве случаевприводит к образованию ненаследуемых амилоидов и потере приона. Аллелиsup35- M1 и sup35-M2 располагаются в пределах региона, необходимого для18поддержания суперскладчатой β-структуры, поэтому они и приводят к исчезновению[PSI+].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
