Автореферат (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 2

Диссертация изложена на 119 страницах исостоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы,результаты, обсуждение, выводы, обзор литературы (223 источника). Работа содержит7 таблиц и 43 рисунка.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫПлазмиды. В работе использовали центромерные плазмиды pRSU1 и pRSU2(Volkov et al., 2002) и их производные, несущие мутации sup35KK (конструкции смутацией sup35-M1 получены в данной работе, остальные предоставленыВ.В. Щепачевым). В ходе экспериментов по индукции [PSI+] дрожжевые штаммытрансформировали плазмидой CEN-GAL-SUP35 (pVK71) (Derkatch et al., 1996) и еепроизводными с мутациями sup35KK.

В ходе работы была получена серия плазмид наоснове pET21b-SUP35NM для очистки из клеток E. coli белков Sup35NM-(His)6,несущих исследуемые замены. Вектор pRS315-SUP35-3HA (Afanasieva et al.,2011) использовали для выявления коагрегации белка Sup35 дикого типа и еговариантов Sup35-M1p и Sup35-M2p. Конструкции для количественной оценкиэффективности нонсенс-супрессии были получены ранее в лаборатории C.В. Пельтца(Wang et al., 2001).Штаммы. Штаммы 10-7A-D832 и 7A-D832 дрожжей S. cerevisiae былипредоставлены А.С. Борхсениусом; их генотипы представлены в таблице 1. На ихоснове в ходе работы получены штаммы 9-10-7A-D832 и 9-7A-D832 (Табл.

1),несущие делецию гена RNQ1. Штаммы OT56([PSI+]s) и OT55([PSI+]w) (изогенныепроизводные от 74-D694 (Chernoff et al., 1995)) были предоставлены Ю.О. Черновым,а субклоны OT56 ([PSI+]nss1,[PSI+]nss2) — А.Г. Матвеенко.Таблица 1. Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе.ШтаммГенотип10-7А-D832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 [pYCM-U2-SUP35] [PSI+][PIN+]7А-D832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 [pYCM-U2-SUP35] [psi-] [PIN+]9-10-7АD832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 RNQ1::KanMX [pYCM-U2SUP35] [PSI+] [pin-]9-7А-D832MAT α ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 SUP35::TRP1 RNQ1::KanMX [pYCM-U2SUP35] [psi-] [pin-]OT56MAT α ade1-14 his3Δ-200 leu2-3,112 trp1-289 ura3-52 [PSI+]s [PIN+]OT55MAT α ade1-14 his3Δ-200 leu2-3,112 trp1-289 ura3-52 [PSI+]w[PIN+]Для сверхпродукции гетерологичных белков использовали штамм BL21 E.

coli(fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] ΔhsdS) (Sambrook et al., 1989).6Генетические методы. В работе использовали стандартные методики генетикидрожжей S. cerevisiae, а также методы работы с бактериальными культурами,описанные в литературе (Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994).При работе с дрожжевыми штаммами использовали стандартные культуральныесреды (Kaiser et al., 1994). Присутствие приона [PSI+] оценивали по способностиклеток дрожжей супрессировать мутацию ade1-14 (UGA), то есть расти на среде безаденина (−Ade), а также белому цвету колоний на ¼ YEPD (Eaglestone et al., 2000).Для получения большого количества биомассы E.

coli использовали среду 2TYа(O’Brien and Aitken, 2001).Оценку эффективности нонсенс-супресии проводили согласно описанным ранееметодикам (Guarente, 1983) с незначительными изменениями. Для оценки количествапропагонов клетки высевали на среду с 5 мМ гидрохлоридом гуанидина.Образовавшиеся колонии затем субклонировали на среде ¼ YEPD и подсчитываликлоны белого или розового цвета, их суммарное количество принимали за числопропагонов на клетку (Cox et al., 2003).Молекулярно-биологические методы. В ходе работы использовали стандартныеметоды работы с нуклеиновыми кислотами: ПЦР, электрофорез ДНК в агарозном геле,рестрикцию, лигирование (Sambrook et al., 1989).

При работе с белками применяликак стандартный протокол SDS-PAGE (Laemmli, 1970), так и специализированныеметодики SDS-PAGE с кипячением геля (сравнение состава белков в агрегированной имономерной фракциях) (Kushnirov et al., 2006), SDD-AGE (оценка размера агрегатовSup35p) (Kryndushkin et al., 2003; Halfmann and Lindquist, 2009). Белкивизуализировали либо с помощью окраски Кумасси (Sambrook et al., 1989), либо погибридизации с антителами (Towbin et al., 1979). Для идентификации Sup35p былииспользованы поликлональные антитела SE4290 к eRF3 (Chabelskaya et al., 2004).Очистку рекомбинантных белков из клеток E.

coli проводили на колонках сNi-NTA Agarose («Invitrogen») согласно описанным методикам (Sambrook et al., 1989),с незначительными модификациями, предложенными для Sup35NMp (Serio et al.,1999).Просвечивающая электронная микроскопия. Агрегаты Sup35NMp окрашивали1 % уранил ацетатом согласно методике позитивного контрастирования (Brum andSteward, 2010). Анализировали препараты на электронном микроскопе JEM Jeol-2100на базе ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.Обработку изображений проводили в программе ImageJ 1.47i (Wayne Rasband NationalInstitutes of Health, USA).Всю статистическую обработку, а также построение графиков осуществляли спомощью пакета R v.

2.4.11 (R Development Core Team, 2011). Для оценкидостоверности отличий между выборками использовали критерий Манна-Уитни(Урбах, 1975).7РЕЗУЛЬТАТЫ1. Характеристика влияния мутантных аллелей sup35KK на стабильность исвойства приона [PSI+]В ходе работы мы исследовали эффекты мутаций sup35KK: sup35-M1 (YQ46-47KK),sup35- M2 (QQ61-62KK), sup35- M3 (QQ70-71KK), sup35-M4 (QQ80-81KK) иsup35- M5 (QQ89-90KK), каждая из них располагается в одном из олигопептидныхповторов (OR) Sup35p.

N-домен Sup35p необходим для поддержания фактора [PSI+](Ter-Avanesyan et al., 1994) и имеет суперскладчатую β-структуру в составе прионныхагрегатов (Shewmaker et al., 2006, 2011). Замены полярных незаряженных остатковаминокислот на заряженные будут приводить к локальному расталкиванию молекулбелка из-за кулоновских взаимодействий между одноименными зарядами (Kajava etal., 2004).Для работы были выбраны два изогенных штамма [PSI+] и [psi-] (10-7A-D832 и7A-D832 соответственно) (Табл. 1). Эти штаммы несут хромосомную делецию генаSUP35 (SUP35::TRP1), компенсируемую его копией, локализованной на центромернойплазмиде.

Мутация ade1-14 (UGA), которая присутствует в этих штаммах, позволяетлегко выявлять наличие в клетках фактора [PSI+] по их нонсенс-супрессорномуфенотипу. Штаммы с прионом могут расти на среде без аденина (фенотип Ade +) иимеют белый цвет колоний на среде ¼ YEPD. Штаммы [psi-], наоборот, не могутсамостоятельно синтезировать аденин (фенотип Ade -), а их клетки накапливаюткрасный пигмент на ¼ YEPD. Штаммы [PSI+] и [psi-] были трансформированыплазмидами pRSU1, несущими мутации sup35KK. Среди полученных трансформантовспособность расти на среде без аденина потеряли только клетки, несущие мутацииsup35-M2 или PNM2 (Рис.

1).Рисунок 1. Потеря прионного фенотипа вприсутствии PNM2 и sup35-M2. Клеткивысеяны в серии пятикратных разведений.Стрелка отражает градиент концентрацииклеток, слева указаны сочетания аллелейSUP35. Мутация PNM2 была использована вкачестве контроля, поскольку она приводит кпотере приона (Doel et al., 1994).Штаммы, полученные на основе проанализированных трансформантов, которыепотеряли аллель дикого типа и сохранили мутации PNM2, sup35-M1 и sup35-M2, немогли расти на среде без аденина (Рис.

2). Исчезновение фактора [PSI+] в этих случаяхбыло необратимым, поскольку замена плазмид с мутациями на вектор с геном дикоготипа не приводила к восстановлению способности расти на среде без аденина (Рис. 2).Мутации sup35-M4 — sup35-M5 могли поддерживать прион, при этом перваяусиливала, а вторая ослабляла его фенотипическое проявление.

Важно такжеотметить, что фактор [PSI+] исчезал при замене sup35-M5 на SUP35 (Рис. 2). Такимобразом, мы предположили, что две из исследуемых мутаций sup35KK приводят кпотере приона, две другие — к изменению варианта [PSI+].8Рисунок 2. Мутации sup35KK приводят к потере или изменению свойств приона [PSI+].Клетки, несущие одну из аллелей, высеяны в серии пятикратных разведений. Под фотографиямипредставлена схема эксперимента по замене аллелей SUP35.Штаммы [psi-], несущие только мутантные аллели SUP35, имеют красный цвет на¼ YEPD и не могут расти на среде без аденина.

Этот факт позволил нам установить,что аллели sup35KK не имеют собственного нонсенс-супрессорного фенотипа. Кромеэтого, эффекты мутаций sup35KK не связаны с изменением содержания белка Sup35 вклетке. Исследуемые мутации не оказывают влияния на функцию и стабильностьбелка.В клетках, несущих фактор [PSI+], Sup35p образует амилоидные агрегаты (Patino etal., 1996; Paushkin et al., 1996; Glover et al., 1997; King et al., 1997) . В штаммах,несущих мутации sup35-M1 и sup35-M2 и потерявших нонсенс-супрессорныйфенотип, отсутствуют и агрегаты Sup35p, что еще раз подтверждает потерю приона.Такое заключение мы сделали на основании результатов электрофорезов клеточныхлизатов с помощью методов SDD-AGE (Kryndushkin et al., 2003; Halfmann andLindquist, 2009) и модифицированного SDS-PAGE (Kushnirov et al., 2006) (Рис.

3).Для проверки способности мутантных белков включаться в прионные агрегатыSup35p мы получили штамм [PSI+], в котором прион поддерживался на фоне химернойконструкции SUP35, слитой с фрагментом, кодирующим гемагглютинин (SUP35-HA)(Afanasieva et al., 2011). Благодаря различиям мутантных белков и белка дикого типа,слитого с гемагглютинином, по молекулярной массе, мы могли отличать их поэлектрофоретической подвижности. С помощью модифицированного SDS-PAGE скипячением геля (Kushnirov et al., 2006) мы показали, что оба мутантных белкаспособны коагрегировать с белком дикого типа в штамме [PSI+] (Рис. 4).А.Б.*Рисунок 3. Аллели sup35-M1 и sup35-M2 приводят к потере агрегатов Sup35p. Наличиеагрегатов Sup35p в лизатах клеток, несущих только мутантные аллели sup35KK, проверено спомощью SDD-AGE (А) и модифицированного SDS-PAGE (Б).