Автореферат (Влияние мутаций в прионизующем домене белка sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae)

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиБондарев Станислав АлександровичВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ПРИОНИЗУЮЩЕМ ДОМЕНЕ БЕЛКА Sup35НА СВОЙСТВА ПРИОНА [PSI+] ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiaeспециальность: 03.02.07 - генетикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург20142Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии Федеральногогосударственногобюджетногообразовательногоучреждениявысшегопрофессиональногообразования«Санкт-Петербургскийгосударственныйуниверситет».Научный руководитель:Доктор биологических наук, доцентГалина Анатольевна Журавлева,профессор кафедры генетики и биотехнологии,Санкт-Петербургский государственныйуниверситет.Официальные оппоненты:Доктор биологических наук,старший научный сотрудникТыну Рихович Сойдла,ведущий научный сотрудник Институтацитологии РАН (Санкт-Петербург).Доктор биологических наук,Светлана Владимировна Саранцева,заместитель директора по научной работеФГБУ "ПИЯФ им.

Б.П. Константинова"НИЦ "Курчатовский институт" (Гатчина).Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетноеобразовательное учреждение высшегопрофессионального образования «Московскийгосударственный университет им. Ломоносова»(Москва).Защита диссертации состоится “ ”2014 г. вчасов на заседаниидиссертационного совета Д 212.232.12 при Санкт-Петербургском государственномуниверситете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.

7/9, СанктПетербургский государственный университет, биологический факультет, кафедрагенетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им М. Горького СанктПетербургского государственного университета и на сайте Санкт-Петербургскогогосударственного университета (http://spbu.ru/).Автореферат разослан "___" ______ 2014 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д 212.232.12,доктор биологических наукЛюдмила Андреевна Мамон3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследования.

Прионы – это белки, способные существовать внескольких конформациях, одна из которых обладает инфекционными свойствами. Умлекопитающих известен только один прион PrP, который вызывает различныенейродегенеративные заболевания. У низших эукариот, дрожжей Saccharomyces cerevisiae,известно более десяти различных прионов, и все они, как правило, не приводят к гибели клетки.Это позволяет использовать дрожжевые прионы в качестве удобной модельной системы дляизучения феномена прионизации. Детерминант [PSI+] – это прионная изоформа белка Sup35,который является одним из факторов терминации трансляции. Его прионизация приводит кснижению эффективности терминации трансляции и нонсенс-супрессии, т.е. считываниюпреждевременных стоп-кодонов как значащих.

Таким образом, его присутствие в клеткахдрожжей можно легко детектировать по фенотипу, во многом благодаря этому свойству [PSI+]является одним из наиболее детально исследованных прионов дрожжей.В клетках дрожжей белки в прионной конформации обычно формируют крупныеамилоидные агрегаты. Такие комплексы характеризуются высокой устойчивостью кнагреванию, действию протеиназ, обработке денатурирующими агентами и т. д. Этисвойства прионов связаны с особой конформацией белковых молекул.

Несмотря напродолжительную историю исследований, вопрос о структурной организации этихагрегатов остается очень актуальным. Изучение этой проблемы осложняетсяневозможностьюиспользованиятрадиционныхметодов(например,рентгеноструктурного анализа), поскольку такие белки имеют тенденцию кспонтанному образованию крупных агрегатов. При этом гипотезы, выдвигаемые наосновании экспериментов in vitro, не всегда применимы к живым системам. In vivoмутационный анализ остается практически единственным подходом, позволяющимполучать сведения о структурной организации белков-прионов.

Представленнаядиссертация посвящена изучению влияния мутаций в N-домене белка Sup35 насвойства приона [PSI+]. В ходе представленной работы удалось описать эффектымутантных аллелей sup35KK, связаные с изменением свойств фактора [PSI+]. In vivo двеиз пяти исследованных мутаций приводят к необратимому исчезновению [PSI+], дведругие — к формированию новых, отличных друг от друга вариантов приона. Дляодной мутации не удалось обнаружить значимых эффектов.

Полученные данныепозволили установить молекулярные механизмы, лежащие в основе обнаруженныхэффектов. Удалось уточнить фрагмент белка, необходимый для поддержанияструктуры исследованного варианта приона. Результаты проведенных in vitroэкспериментов показали, что все исследованные мутации влияют на структуруагрегатов Sup35p. Представленные данные являются актуальными, посколькуописывают различные модификации свойств фактора [PSI+] под влиянием мутацийsup35KK и вносят существенный вклад в понимание фундаментальных механизмов,определяющих свойства и особенности структурной организации дрожжевыхприонов.Целью работы стала идентификация молекулярных механизмов, лежащих воснове влияния мутаций в N-домене Sup35p на свойства приона [PSI+].

В ходеисследования решали следующие задачи: (1) характеристика влияния мутантныхаллелей sup35KK на свойства приона [PSI+]; (2) изучение влияния комбинациймутантных аллелей sup35KK на стабильность приона [PSI+]; (3) проверка влияниямутантных аллелей sup35KK на различные варианты приона [PSI+]; (4) исследованиезависимости эффектов мутантных аллелей sup35KK от [PIN+]-статуса клеток; (5)4характеристика фибрилл, образованных мутантными белками in vitro.Научная новизна исследования. В представленной работе описано влияниеновых мутаций в N-домене белка Sup35 на свойства приона [PSI+]. В отличие отбольшинства предшествующих работ, мутации были получены не случайнымобразом, а с помощью сайт-направленного мутагенеза на основании предсказаниймодели супер-складчатой β-структуры, которая описывает принципы стабилизацииприонных агрегатов Sup35p.

Исследуемые мутации затрагивают участок белка, вкотором раньше не было обнаружено аминокислотных замен, приводящих к потереприона. Важно также отметить, что впервые был обнаружен эффект «усиления»фактора [PSI+] под действием мутации sup35; ранее в литературе были описаны толькоаллели, приводящие к потере приона. С помощью сочетания методов классическойгенетики и молекулярной биологии удалось охарактеризовать молекулярныемеханизмы действия каждой из аллелей.Теоретическая и практическая значимость работы. Представленная работаявляется полноценным и законченным исследованием, сочетающим в себе подходыклассической генетики и современной молекулярной биологии.

Полученныерезультаты вносят существенный вклад в понимание фундаментальных механизмов,определяющих свойства и особенности структурной организации дрожжевыхприонов. В рамках представленной работы определен фрагмент белка, необходимыйдля поддержания исследованного варианта приона [PSI+]. Также показанымодификации структуры агрегатов Sup35p под действием мутантных аллелей sup35KK.Кроме этого, описаны изменения свойств приона в присутствии мутаций иохарактеризованы молекулярные механизмы, лежащие в их основе.

Исследованиепринципов, обеспечивающих поддержание структуры прионов, создает предпосылкидля разработки подходов к терапии заболеваний, вызываемых накоплением аномальноуложенных белков. Полученные данные также могут служить основой для созданияметодов направленного изменения свойств прионов, а также для созданиялекарственных средств против заболеваний, вызываемых накоплением амилоидов.Результаты работы могут быть использованы при подготовке материалов лекцийпо курсам «Молекулярная генетика», «Частная генетика дрожжей», «Генетическийконтроль трансляции» и «Прионы», преподаваемым на кафедре генетики ибиотехнологии СПбГУ, и аналогичных курсов в других высших учебных учрежденияхРоссии.Положения, выносимые на защиту.

Исследованные мутации влияют наструктуру агрегатов Sup35p, что может приводить как к потере фактора [PSI+], так и кизменению его свойств. Мутация в первом олигопептидном повторе затрудняетобразование гомоагрегатов соответствующего белка. Белок Sup35-M2 приприсоединении к прионному агрегату приводит к формированию ненаследуемыхамилоидов. Мутация sup35-M4 способствует образованию более «сильного» вариантаприона из-за укорочения фрагмента белка, вовлеченного в формированиесуперскладчатой β-структуры.

Ослабление приона [PSI+] в клетках, несущих мутациюsup35-M5, связано с уменьшением числа пропагонов в клетке.Апробация работы. Данные, представленные в диссертации, опубликованы ввиде пяти статей, три из которых в рецензируемых высокорейтинговых журналах иизданиях, рекомендованных ВАК. Материалы работы также были представлены намеждународных и российских конференциях: на V съезде ВОГиС (Москва, 2009),конференции “Yeast: an evergreen model system” (Rome, Italy, 2010), на V5Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянствогенома» (Звенигород, 2012), CNRS–Jacques Monod Conference “Protein misfolding indisease: molecular processes and translational research toward therapy” (Roscoff, France,2013), 25-26th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology(Olsztyn, Poland, 2011; Frankfurt/Main, Germany, 2013).Объем и структура диссертации.