Автореферат (Эффекты и механизмы ишемического прекондиционирования и посткондиционирования головного мозга), страница 4

ссоавт., 2008; Chen S.T. et al., 1986).Оценка неврологического дефицита осуществлялась по шкале оценки инсульта(stroke-index), разработанной С.Р. McGraw (1977) с модификациями K. Ohno с соавт. (1984).Учет летальности животных. Общую летальность вычисляли как отношениеколичества невыживших животных к концу эксперимента (или к анализируемой точкеэксперимента) к общему числу животных в каждой группе.13Методика морфологического и морфометрического анализа. Сегменты головногомозга фиксировали формалином и заливали в парафин по общепринятой методике(Меркулов Г.А., 1969; Коржевский Д.Э., Гиляров А.В., 2010; O’Neill M.J., Clemens J.A.,2001). Готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм, соответствующие стереотаксическиматласам головного мозга монгольской песчанки брегма -1,7±0,2 мм (Loskota W.J., 1974) икрысы брегма -3,6±0,2 мм (Paxinos G., Watson Ch., 1998), окрашивали гематоксилиномэозином и толуидиновым синим по методу Ниссля (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996).

Наокрашенныхпрепаратахподсветовыммикроскопомпроводиликачественныйиколичественный морфологический анализ полей СА1, СА2, СА3 и СА4 гиппокампа и слоевII, III и V коры головного мозга. Для морфометрического анализа на нескольких срезах приувеличении ×400 (об. 40, ок. 10) подсчитывали количество морфологически неизмененныхпирамидных нейронов для полей гиппокампа и затылочной области (occipital cortex) корыголовного мозга, в ее отдельных слоях, а именно, в слоях II, III и V. Полученныеколичественные показатели пересчитывали на 1 мм протяженности пирамидного слоя дляполей гиппокампа и на 1 мм2 для послойного анализа коры.

Морфологически неизмененныенейроны оценивали в соответствии с существующими критериями оценки: четко очерченноеядро эллипсоидной или округлой формы; хорошо различимые ядрышки, расположенные вцентре ядра; ядро немного темнее, чем окружающий нейропиль; цитоплазма нейронов четкоотграничена от окружающего нейропиля (Stummer W. et al., 1994).

Учитывались нейроны,сохранившиежизнеспособность(т.е.морфологическинеизмененныенейроны)исодержащие в площади среза ядрышко (Kirino T., 1982).Методика иммуногистохимической детекции белка Bcl-2. Фронтальные срезымозга подвергали стандартной процедуре депарафинирования и регидратации, осуществлялитепловое демаскирование антигена в цитратном буфере. Проводили инкубацию срезов споликлональными кроличьими антителами к Bcl-2 (1:100, Abcam Ltd, Великобритания). Длявыявления комплекса антиген-антитело применяли набор реагентов Novocastra PeroxidaseDetection System (Novocastra, Великобритания).

Продукт иммуногистохимической реакциивыявляли при помощи хромогена DAB+ (Novocastra, Великобритания). Препаратыдокрашивали гематоксилином Джилла (Bio-Optica, Италия). Экспрессию белка Bcl-2 вцитоплазме неизмененных нейронов анализировали на основании результатов измеренияоптической плотности продукта реакции, которую осуществляли с помощью программногообеспечения «Видео-ТесТ-Морфология» (ООО «ВидеоТесТ», Россия).Методикагистохимическогосукцинатдегидрогеназыиисследованиялактатдегидрогеназы.внутриклеточнойГистохимическоеактивностиисследованиепроведено в лаборатории патоморфологии (зав. - к.б.н., доцент Г.Ю. Юкина) Научноисследовательского центра (директор – д.м.н., профессор В.В. Томсон) ФГБОУ ВОПСПбГМУ им.

И.П. Павлова Минздрава России. Сегменты головного мозга ступенчатозамораживали, проводя через охлажденный изооктан в жидком азоте. Образцы мозга14хранили в жидком азоте при температуре -179ºС. С помощью криостата (при -20ºC) готовилисрезы мозга во фронтальной плоскости толщиной 10 мкм, на них стандартнымигистоэнзимологическими методами с применением солей тетразолия по З.

Лойда (Лойда З. ссоавт, 1982) выявляли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и сукцинатдегидрогеназы(СДГ) в нейронах слоев II, III и V коры головного мозга и полей СА1, СА2, СА3 и СА4гиппокампа. На спектроцитофотометре (ОАО «ЛОМО», Россия) плаг-методом приувеличении ×280 (площадь зонда составляла 0,785 мкм2, длина волны - 545 нм) определялиоптическую плотность продукта реакции (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977; ПрочухановР.А. с соавт., 1978).

Результаты цитофотометрического анализа выражали в относительныхединицах (отн. ед.) оптической плотности.Функциональная активность компонента С3 системы комплемента в сывороткекрови крыс определялась с использованием реагента RC3. Реагент RC3 представляет собойсмесь донорских сывороток крови человека, в которой белок С3 был предварительноинактивирован (Козлов Л.В. с соавт., 1987; Бельтюков П.П. с соавт., 2003). В ходе анализа креагенту RC3 (0,2 мл) добавляли 0,2 мл мединалового буфера, содержащего 17 мМ Mg2+ и5,1 мМ Ca2+, 0,3 мл 0,9% раствора NaCl и 0,02 мл исследуемой разведенной сыворотки кровикрыс.

После прогревания смеси в неё вносили 0,1 мл стандартной суспензии эритроцитовкролика (около 1,2×106 эритроцитов/мл). В такой смеси благодаря присутствию как ионовмагния, так и ионов кальция активация комплемента возможна по любому из существующихмеханизмов.Кинетикукомплемент-опосредованногогемолизарегистрировалифотометрически на спектрофотометре СФ-46 (ОАО «ЛОМО», Россия) с регистрациейоптической плотности при 800 нм каждые 5 секунд. Были определены: лаг-период (Tlag) время инкубации смеси от момента добавления эритроцитов до начала эффективногогемолиза, скорость лизиса (Vlys) – максимальная скорость гемолиза, которая определяетсякак снижение оптической плотности инкубационной смеси в единицу времени (dE800/5″) иTmax – время достижения Vlys.Методыстатистическогоанализа.Статистическуюобработкурезультатовпроводили с использованием пакета программ "STATISTICA 6.0" (StatSoft Inc., США).Различия считали значимыми при Р<0,05.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕРАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ПОЛНОЙ ГЛОБАЛЬНОЙИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫСМоделирование полной глобальной ишемии-реперфузии головного мозга у крысЗадачей данной разработки являлось создание модели полной глобальной ишемии головногомозга,проводимойводинэтапипозволяющеймоделироватьишемическоеиреперфузионное повреждение всего головного мозга заданной продолжительности снаименьшими травматическими последствиями и высоким процентом достижения состояния15глобальной ишемии.

Эксперимент проводили в условиях общей анестезии и пневмоторакса,поэтому было необходимо выполнение искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ) с помощьюаппарата SAR830 (CWE Inc., США), в режиме постоянного дыхательного объёма. Посленаркотизации крыс интубировали при помощи специально разработанной и запатентованнойинтубационной трубки (рис.

1). Диаметр эндотрахеальной трубки выбирался соизмеримым сразмером трахеи животного, что позволяло ограничить раздражение и растяжение стенокгортаниитрахеи.Разработаннаяконструкцияинтубационнойтрубкипозволялаосуществлять удаление накапливающейся в верхних дыхательных путях слизи в процессевсего эксперимента без полного прекращения искусственной вентиляции легких и остановкиИВЛ. На коже проводили L-образный разрез по средней линии груди, а затем вподмышечную область, после чего кожный лоскут отделяли по линиям разреза, аналогичнымобразом отделяли большую и малую грудные мышцы.Рис. 1. Чертеж конструкцииразработанной интубационной трубки.Интубационная трубка – 1; отвод дляаспирации слизи – 2; заглушка – 3;переходник – 4; эндотрахеальнаятрубка – 5; проксимальный конец – 6.Затем следовал разрез по нижнему краю III ребра, через который осуществлялидоступ в грудную клетку.

Проводили выделение дуги аорты и отходящих от неемагистральных сосудов: плечеголовного ствола, левой подключичной артерии и левойобщей сонной артерии (tr. brachiocephalicus, a. subclavia sin., a. carotis communis sin.). Подпрепарированныесосудыподводилилигатуры(рис.2)изатемнакладывалимикрохирургические зажимы, что приводило к прекращению кровоснабжения головногомозга. Снятие зажимов позволяло восстановить перфузию головного мозга. Далее дляликвидациипневмотораксапослойноушивалиоперационнуюрану,проводиливосстановление самостоятельного дыхания.Валидацияразработанноймоделиполнойглобальнойишемии-реперфузииголовного мозга у крыс проводилась несколькими способами.