Автореферат (Свободные и координированные ионами Pt(II), Pd(II) тетразолилуксусные кислоты как перспективные скаффолды в синтезе новых биологически активных веществ), страница 3

Взаимодействие с ДНКОднимизраспространенныхспособовисследованиямеханизмапротивоопухолевой активности металлокомплексов является изучение ихвзаимодействия с олиго- либо полинуклеотидами с помощью различных физикохимических методов in vitro, таких как УФ-спектроскопия, спектроскопия круговогодихроизма, исследование электрофоретической подвижности, вискозиметрия.2.3.1.1. УФ-спектроскопияСпектры УФ-поглощения были записаны для смеси постоянной концентрацииДНК тимуса телёнка (3.0 мкМ) с различными концентрациями соединений 21-28, 3034 (Рисунок 3).Нормированные спектры ДНК в состоянии связывания показывают, что принизких значениях r (<0.45) наблюдается увеличение интенсивности поглощения ДНКвместе с батохромным сдвигом максимума полосы ДНК, что свидетельствует освязывании металлокомплексов с N7 атомом гуанина.

При более высоких значениях r(> 0.45) наблюдается незначительный гипохромный эффект, что может говорить одополнительном взаимодействии (например, включение второй молекулы комплексав ассоциацию с ДНК).0,40,30,20,1Elipticity 10Dcalc0,5-32DNA0.010.020.0750.1750.2250.451231DNA0.30.71.01.50-10,0240250260270280Wavelengh (nm)290300240260280300Wavelength (nm)Рисунок 3. Вычисленные УФ-спектры растворов ДНК Рисунок 4. КД-спектр ДНК в присутствиив 5 мМ NaCl с различными концентрациямиразличных количеств комплекса 27 прикомплекса 27;следующих стехиометрических соотношениях:c(ДНК) = 3×10-5 M (пар оснований) = const.z = [комплекс металла] / [ДНК] =(Dвычисл.

= D(DNA – комплекс 27) –=0.0, 0.3, 0.7, 1.0 в 5 мМ NaClD(комплекс 27)).Кроме того, были записаны УФ-спектры растворов ДНК в присутствиикомплекса 27 при более высокой ионной силе (1М NaCl). В этом случае приувеличении концентрации комплекса спектр ДНК практически не изменялся, что,очевидно, свидетельствует об отсутствии взаимодействия между ними. Стольсильное влияние ионной силы на возможность вышеописанного взаимодействияможет свидетельствовать о его электростатической природе хотя бы на одной изстадий взаимодействия. Нами были записаны спектры при различных концентрацияхДНК при постоянной концентрации соединений (10 -6 М).

Предполагая, что в14связывании с ДНК участвуют только хромофоры комплексов, а также равновесныйхарактер связывания, мы рассчитали константы связывания Кb с использованиемуравнения:где Kb - константа связывания; [ДНК] представляет собой концентрацию ДНК, а εa, εfи εb – наблюдаемый коэффициент молярной экстинкции (Aobs/[M]), коэффициентмолярной экстинкции свободного комплекса металла (M) и коэффициент молярнойэкстинкции комплекса металла (M) в полностью связанной форме соответственно.Зависимость [ДНК]/(εа–εf) линейна для всех комплексов.Значения Кb находятся в диапазоне, эффективном для связывания с ДНК исогласуются с данными величинами для известных цитостатиков.Таблица 3.

Величины2.3.1.2. Спектроскопия кругового дихроизмаконстантсвязывания KbСпектры КД (рис. 4) были записаны при постояннойассоциации комплексов сконцентрации ДНК тимуса телёнка (3,0 μM) и различныхДНК тимуса теленкамолярных соотношениях комплексов металлов: 34 и 37,Компл.Kb (M-1)содержащие одинаковый лиганд – этиловый эфир 5-метил244.64×1051Н-тетразол-1-илуксусной кислоты и отличающиесяся255.68×105металлическими центрами [Pd(34), Pt(37)], а также265.02×105комплексы 28(Pd) и 29(Pt) (лиганд – этиловый эфир 2274.80×105трет-бутил-2Н-тетразол-5-илуксуснойкислоты).301.33×106Увеличение концентрации комплексов приводит к343.67×105уменьшению интенсивности поглощения ДНК как в357.82×105положительной, так и в отрицательной области спектра.365.93×105Эти изменения в спектрах кругового дихроизма могут378.82×105соответствовать взаимодействию соединения с ДНК помеханизму бороздочного связывания.Добавление некоординированного этилового эфира 4 к раствору ДНК неприводит к изменению её спектров кругового дихроизма, что свидетельствует оботсутствии взаимодействия.2.3.1.3.

Термическая денатурация ДНКДля определения силы взаимодействия ДНК с комплексами платины ипалладия, определяли температуру плавления раствора нативной ДНК тимусателёнка и раствора ДНК после смешивания с растворами комплексов 24, 25, 28, 29,31, 32, 38 и 39 (Рисунок 5). Во всех случаях добавление комплексов к раствору ДНКвызывает увеличение ΔTm ≥ 8 °C. Данный факт свидетельствует о сильнойстабилизации двойной спирали, обусловленной взаимодействием данных комплексовметаллов с ДНК.15DNAcomplex 28+DNAcomplex 36+DNA0,320.8red/red(DNA)Absorbance0,301.00,280,260,240.60.4120.20,220,2030405060708090oTemperature ( C)Рисунок 5.

Кривые плавления ДНК (1,0 мкМ) вотсутствие и в присутствии комплексов 28 и 36в 5 мМ NaCl в стехиометрическом соотношении:z = [комплекс металла] / [ДНК] = 1.5.0.00.000.050.100.150.200.25Ccomplexx104, MРисунок 6. Зависимость вязкости ДНК-растворовот концентрации комплекса 24 (транс-[PdCl2L2],L = этиловый эфир-2-трет-бутил-2Н-тетразол5-илуксусной кислоты) в 5 мМ NaCl. [ДНК] =0,0066%, (66 мкг/мл).2.3.1.4. ВискозиметрияВлияние тетразолсодержащих транс-комплексов на гидродинамическиесвойства ДНК рассмотрено на примере комплекса 34 (транс-[PdCl2L2], L = этиловыйэфир-2-трет-бутил-2Н-тетразол-5-илуксусной кислоты).Полученные данныесвидетельствуют о том, что добавление комплекса к раствору ДНК вызываетуменьшение вязкости раствора (Рисунок 6). Уменьшение вязкости может бытьобусловлено уменьшением размера биополимера в присутствии соединения 34.Уменьшение объёма ДНК может сопровождаться перегибами двойной спирали ДНК,что характерно для бороздочного связывания комплексов металлов с ДНК.2.4.1.5.

Исследование электрофоретической подвижностиВ настоящей работе исследовали способность комплексов 33, 34, 28, 29, 30, 31способствовать превращению суперспирализованной формы плазмидной ДНКpBR322 в открытую кольцевую форму с использованием электрофореза в агарозномгеле (Рисунок 7). Результаты гель-электрофореза говорят о том, что при рН 7.2 всесоединения взаимодействуют с ДНК. Электрофореграмма демонстрируетконцентрационную зависимость электрофоретической подвижности.Результаты гель-электрофореза говорят о том, что при рН 7.2 все соединениявзаимодействуют с ДНК и приводят изменению к электрофоретической подвижностиплазмиды. Такие данные свидетельствуют о том, что добавление металлокомплексовк биополимеру приводит к изменениям в третичной структуре ДНК.Рисунок 7.

Электрофореграмма плазмидной ДНК pBR322 (300 нг) в агарозном геле, после обработкикомплексами 33 и 34 (0.1-0.4 мМ). 1: контроль; 2: 0.1 мМ компл. 33 + ДНК; 3: 0.2 мМ компл.33 + ДНК; 4:0.4 мМ 33 + ДНК. 5: 0.1 мМ 34 + ДНК; 34: 0.2 мМ 34 + ДНК; 7: 0.4 мМ 34 + ДНК, 8: маркер. pH 7.2, 25 °С.162.3.1.6. Молекулярный докинг комплексов Pd(II) и Pt(II)с додекамером ДНК d(CGCGAATTCGCG)2Для установления типа взаимодействия исследуемых металлокомплексов сДНК было проведено молекулярное моделирование ассоциатов металлокомплексовPd(II) и Pt(II) 28 и 29, содержащих этиловый эфир 2-трет-бутил-тетразол-5илуксусной кислоты в качестве лиганда с додекамером d(CGCGAATTCGCG) 2 {PDBID: 1BNA} – молекулярный докинг (Рисунок 8).

Расчёты были выполнены методоммолекулярной динамики.AБРисунок 8. Результаты молекулярного докинга металлокомплексов 24 (модель A) и 25 (модель Б) сДНК (PDB ID: 1BNA).Согласно результатам расчётов, наивысшая афинность связывания комплексовс ДНК наблюдается в случае связывания метталлокомплексов с малой бороздой ДНК.Данный тип взаимодействия реализуется как в случае комплекса Pt(II), так и в случаеPd(II).2.4.2.

Исследование взаимодействия комплексов с БСА2.4.2.1. УФ-спектроскопияЭффективность взаимодействия комплексов с БСА можно оценить с помощьюУФ-спектроскопии и флуориметрии. Нами были записаны УФ-спектры БСА вприсутствии комплексов 25, 28, 34 (Рисунок 9). При увеличении концентрациикомплексов 28, 34 интенсивность поглощения при 226 и 278 нм заметноуменьшается. Это указывает на то, что комплексы 28, 34 специфическим образомвзаимодействуют с БСА, что может вызывать конформационные изменения вструктуре α-спирали и изменять полярность микросреды в области остатковтриптофана, по аналогии с известными литературными данными.1.0Fluorescence IntensityAbsorbance800.50.0200220240260280300320Wavelength (nm)Рисунок 9. Спектры УФ-поглощения БСА (c = 20.0μM) в присутствии различных концентрацийкомплекса 30 (от 16.0 до 40.0 μM), рH 7.2).6040200300350400Wavelength (nm)Рисунок 10.

Эмиссионные спектры БСА (c = 1,0мкМ) в присутствии различных концентрацийкомплекса 24 (0.4 - 4,0 мкМ) рН 7.2.17В случае комплекса кислоты 25 изменения крайне незначительны. Отсутствиеданного взаимодействия в последнем случае может быть обусловлено диссоциациейкарбоксильной группы до соответствующего карбоксилат-аниона при рН 7.2, чтовызывает электростатическое отталкивание между молекулами металлокомплекса иБСА.2.4.2.2.

Метод флуоресцентной спектроскопииФлуоресценция БСА определяется наличием в молекуле альбумина остатковTrp-134 и 213.Спектры флуоресценции БСА регистрировались при различных концентрацияхкомплексов 24, 29, 34 и 35 (Рисунок 10).С увеличением концентрации комплексов 24, 29 и 34 интенсивностьфлуоресценции раствора БСА в области 345 нм уменьшается (Рисунок 2.11). Этоможет указывать на то, что комплексы 24, 29 и 34 взаимодействуют с БСА, чтоприводит к конформационным изменениям структуры белка, связанным сизменениями в микросреде в области триптофана.Эффективность взаимодействия может быть оценена по величинесоответствующей константы связывания (Kbin) между БСА и комплексом. ВеличинуKbin между БСА и соединением вычисляли по уравнению Скэтчарда:,где I0 и I - интенсивности флуоресценции белка в отсутствие и в присутствиикомплекса металла соответственно, [M] – концентрация комплекса металла, Kbin –константа связывания, а n представляет собой число сайтов связывания.Значения Kbin составляют 4.12×105 л M-1 для комплекса 24; 1,61×105 л моль-1 –для комплекса 29 и 8.32 × 104 л моль-1 для комплекса 34.