Отзыв официального оппонента (Спектрально-кинетические исследования фотофизических процессов с участием молекул красителей и биомолекул в присутствии наночастиц серебра)

официального оппонента о диссертационной работе Зюбина Андрея Юрьевича «Спектрально-кинетнческие исследования фотофиз ических процессов с участием молекул красителей н биомолекул в присутствии наночастиц серебра», представленной на соискание степени кандидата физико-математических наук по специальности 01.04.05 — «оптикюь Диссертационная работа Зюбина Андрея Юрьевича посвящена экспериментальному изучению фотофизических процессов поглощения, флуоресцеиции, комбинационного рассеяния с участием НЧ серебра, биомолекул н красителей на поверхности твердого тела, в полимерных матрицах и в растворах.

В связи с развитием нанатехи ело гий создание и изучение различных нанострукгурированных объектов и материалов с разнообразными свойствамн привлекает большой интерес. На основе таких объектов разрабатываются новые технологии н устройства. Использование наночастиц ~ета~~~~ в и~выл технологиях объясняешься особенностями их электронной структуры. Оптические свойства наночастнц представляют особый интерес для фундаментальных и прикладных исследований.

В частности, использование плазм а нного резонанса нано частиц, фиксированных на различных диэлектрических подложках или в матрицах, открывает возможности для создания материалов с новыми и весьма полезными оптическими свойствами. Такие структуры используются, например, в спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния. Этот метод в настоящее время активно применяется в медицинских исследованиях и имеет большие перспективы, т.к. дает возможность диагностики по исследованию образцов в малых количествах.

Развитие комбинационной спекгроскопии ближней инфракрасной области с преобразованием Фурье расширило возможности применения данного метода в бномедицинских целях. Изучение фундаментальных процессов, происходящих в структурах, содержащих металлические наночастицы, создание новых систем, их апробация и усовершенствование необходимы для успешного внедрения новых методов и подходов, например„к исследованию биологических объектов. Диссертационная работа Зюбина Андрея Юрьевича имеет прямое отношение к этим исследованиям.

В связи с этим очевидны ее актуальность и практическая значимость, Особенностью диссертационной работы является решение ряда методологических задач, связанных с подготовкой пленок ПВС на поверхностях шероховатого стекла с НЧ серебра, а также применение оптических методов к исследованию биологических обьектов— сывороточного альбумина человека (САЧ) н АТФ. Сывороточный альбумин составляет более половины от всех белков в плазме крови. Этот белок изучен достаточно хорошо, Являясь активным атранспортным средспюмгь он, в частности, способен связывать лекарственные препараты и различные токсичные вещества. Его синтез зависит от состояния организма, а некоторые заболевания, к числу которых относится сепсис, оказывают влияние на производство САЧ. Данные о модификации структуры альбумнна при развитии патологий противоречивы (от отсутствия конформационных изменений белка до его частичной денатурацни).

В диссертационной работе рассматриваются спектральные особенности этого белка при развитии сепсиса. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка цитируемой литературы и 2 приложений. Работа изложена на 160 страницах, содержит 54 рисунка и 9 таблиц, Список литературы включает 239 наименований. Во введении приводится необходимые сведения о работе, отмечены ее актуальность„ новизна и практическая ценность, сформулирована цель, перечислены задачи, предмет и методы исследования, Приводятся положения, выносимые на защиту, содержатся сведения о личном вкладе автора, об апробировании результатов работы.

Первая глава диссертации содержит обзор современного состояния методов флуоресцентной и ИК спектроскопии, спекгроскопии комбинационного рассеяния, их применения для анализа структуры и свойств биологических молекул, Рассмотрены теоретические основы описания и использование плазмонных эффектов в оптической спектроскопии, проанализированы особенности химических и физических методов синтеза наночастнц серебра. Во второй главе подробно описано изготовление наноструктурированных плазмонных материалов, включая синтез наночастнц серебра, изготовление модифицированных шероховатых стекол и выделение белковой зкстракции сывороточного альбумина человека.

Здесь же описаны экспериментальные установки и даны необходимые сведения об использовании методов флуоресцентной и ИК спектроскопии, поверхностно- усиленного комбинационного рассеяния, приведена методика определения внутриклеточного и внутримитохондриального АТФ у детей с острым лимфобластным лейкозом. Третья глава диссертации посвящена исследованию комбинационного рассеяния и флуоресценции молекул родами на бж на шероховатом стекле и в пленках полнвинилового спирта с наночастицами серебра. Рассмотрено влияние температурной обработки на морфологию и структурные свойства шероховатых стекол, приводятся результаты по рассмотрению металл-усиленной флуоресценции и поглощения молекул родамина 6Ж в матрице поливинилового спирта и на поверхности шероховатого стекла. В четвертой главе приведены результаты спектроскопических исследований струкгуры молекулы САЧ и рассмотрена флуоресценция остатка триптофана в норме н прн сепсисе.

Для анализа конформационных изменений сывороточного альбумина человека используется спектроскопия поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния света, ИК-Фурье и флуоресцентная спектроскопия, в том числе поляризованная флуоресценция. Самая короткая питая глава содержит результаты исследований, которые легли в основу разработки флуоресцентного метода анализа концентрации аденозинтрнфосфата (АТФ) в клетках крови и митохондриях. Новизна выполненной работы заключается в использовании биосовместимых модельных матриц (шероховатое стекло, ПВС с внедренными НЧ серебра) для усиления флуоресценции, поглощения и комбинационного рассеяния, в проведении сравнительного анализа оптических свойств сывороточного альбумина человека в норме и при сепсисе.

Дййгйййпййсть полученных научных результатов обеспечивается использованием апробированных методик измерения, повторяемостью и согласованностью результатов, публикацией основных положений диссертации в рецензируемых журналах и их обсуждением на международных н всероссийских симпозиумах и конференциях.

При чтении диссертации возникает ряд вопросов. Стоит подчеркнуть, что рабата с биологическими макромолекуламн требует особого подхода, Несмотря иа то, что диссертационная работа Зюбина Андрея Юрьевича представлена на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности «оптика», целый ряд вопросов связан с состоянием обьектов исследования и с процессом пробоподготовки. Вопросьз и замечании.

1, Как определяется концентрация наиочастиц серебра в образцах? 2. На рнс. 3,9 (рис. 1 автореферата) существенное увеличение поглощения Р6Ж в пленке ПВС на шероховатом стекле, модифицированном НЧ серебра (например, при концентрации наночастиц 4,5«10 '~ М вЂ” более чем в 2,5 раза), сопровождается сравнительно малым (менее чем в 1,2 раза) увеличением интенсивности люминесценции. Это не позволяет говорить о возрастающей флуоресценции Р6Ж в рассматриваемых условиях. Почему не приведены спектры возбуждения, которые в какой-то мере прояснили бы этот результат? 3. Вызывает вопросы и выполненный расчет оценки параметров переноса энергии с исполыюванием модели Ферстера (стр. 99). В диссертации отмечается: «При увеличении концентрации серебра вследствие без ызлучательного переноса электронной энергии с НЧ на молекулы красителя происходит увеличение нх поглощательной способности» (стр.

93) и «Поскольку максимум поглощения НЧ серебра (средний днметр 64 нм) приходился на длину волны Х = 416 нм, а максимум флуоресцеицин Р6Ж находится в области 570 нм, то можно ожидать, что в результате частичного перекрытия спектров, усиления флуоресценции в 6. 7. 8. 9. результате безызлучательного йд-переноса по Ферстеру с РбЖ на НЧ серебра» (стр. 99).

О каком переносе и каком перекрывании ндег речь? В диссертации в главе 2 описывается способ выделения САЧ, где указано: «денатурнрующий агент частично убирался, и часть САЧ переводилась в исходное состояние». Не означает ли эго, что при использовании разных проб наличие остатков денатурирующего агента и приводило к вариации экспериментальных данных (в частности, на стр. 110 отмечено, что «повторяемости сигнала КР белковой молекулы достичь не удалось»). Вызывает удивление спектральный сдвиг при использовании САЧ, выделенного из крови больных, по сравнению с САЧ в норме — рис.

4.9 диссертации и 4 автореферата (на рисунке 4.9 и в тексте диссертации ошибочно длина волны дана в см'). Как известно, при сравнении люминесценции триптофана в составе белка (обычно около 343 нм) и в свободном состоянии в растворе (348-350 нм) этот сдвиг существенно меньше (при денатурации белков максимум сдвигается к 350 нм). На стр. 120 в качестве возможной причины рассматривается наличие «слабокислой среды окружения белковой глобулы вследствие использования 5% раствора сульфосалнцнловой кислоты для осаждения белка из плазмы», Относится ли зто только к «патологическому» САЧ7 Контролировали ли степень чистоты белка САЧ, величину рН в используемых для приготовления образцов пробах и ионную силу раствора (зарядовые свойс гва белка играют важную роль а определении его конформации)? Диагноз «сепсис» имеет различную этнологию (вызываться различными микроорганизмами, сопровождаться разной реактивностью организма).