Автореферат (Структура острова патогенности XII стрептококков группы В), страница 2

Показанаспособность острова патогенности и геномного островка образовыватьциклическую структуру. Частота встречаемости гена sspB1а и островапатогенности PAI-A1 превышает частоту встречаемости гена sspB1 и островапатогенности PAI-A.Теоретическая и практическая значимостьСтрептококки группы В впервые были обнаружены как возбудители маститау коров. В настоящее время установлено, что СГВ вызывают широкий спектрзаболеваний человека и животных. Они способны быстро адаптироваться кизменяющимся условиям окружающей среды за счет содержания в геномемобильных элементов. Адаптации бактерий к разным экологическим нишамспособствуют острова патогенности, ассоциированные с факторами патогенности.Установлено, что характер течения инфекционного заболевания связывают сналичием определенного острова патогенности.

На острове патогенности,ассоциированном с геном sspB1, локализованы гены различных факторовпатогенности. В связи с тем, что наличие острова с генами sspB семейства вштаммах СГВ коррелирует с инфекциями в урогенитальном тракте, вызваннымиданными штаммами, понимание организации и распространенности островапатогенности имеет большое практическое и теоретическое значение. Выявлениероли отдельных генов на данном генетическом элементе в формированиивирулентного фенотипа позволяет глубже понимать патогенез стрептококковойинфекции, а также использовать их в качестве маркеров для детекциивысоковирулентных штаммов стрептококков группы В, обнаруженных убеременных.

В свою очередь выявление носительства вирулентных штаммов убеременныхпозволитснизитьрискинфицированияноворожденныхстрептококками группы В.Методология и методы исследованияМетодологией исследования является экспериментальная работа по анализугеномовштаммовстрептококковгруппыВсиспользованиеммикробиологических, молекулярно-биологических, молекулярно-генетическихметодов. Данные обрабатывали с помощью компьютерного и статистическогоанализов.Положения, выносимые на защиту1) Остров патогенности XII состоит из трех мобильных генетических элементов,каждый из которых включает элементы, необходимые для транспозиции.72) Остров патогенности PAI-A обнаруживается в штаммах стрептококков группыВ из России (Санкт-Петербурга) и не определяется в штаммах СГВ иззарубежных стран.3) Остров патогенности PAI-A1 циркулирует в штаммах СГВ из различных стран иболее широко распространен, чем остров патогенности PAI-A.Степень достоверности и апробация результатовСтепень достоверности полученных результатов определяется достаточнымобъемом выборки (235 штаммов СГВ), использованием молекулярно-генетическихметодов, компьютерного анализа и точного критерия Фишера.Результаты исследования были доложены на V конференции молодыхученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогрессклинической медицины», на III Международном молодежном медицинскомконгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2009», на 20-м Европейскомконгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, наВсероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской наукитретьего тысячелетия», на XVIII Международном Симпозиуме Лэнсфильд, на IIвсероссийскойнаучнойконференциимолодыхученых«Проблемыбиомедицинской науки третьего тысячелетия».Объем и структура диссертационной работыДиссертация изложена на 112 страницах, состоит из введения, обзоралитературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, спискасокращений, списка литературы.

Список литературы включает в себя 130источников, в том числе 15 – отечественных и 115 – иностранных. Диссертацияиллюстрирована 14 таблицами и 27 рисунками.Основное содержание работыМатериалы и методы исследованияВ данном исследовании использовались 235 штаммов стрептококков группыВ, полученных из различных коллекций России (113 штаммов), США (12штаммов), Чешской республики (9 штаммов), Германии (16 штаммов), Португалии(56 штаммов) и Анголы (19 штаммов).Штаммы из Германии, Португалии, Анголы относились к двум группам:инвазивные (45 штаммов) и выделенные от носителей (46 штаммов).Штаммы Escherichia coli (E.

coli) DH5α, JM109, M15 были использованы присоздании конструкций для экспрессии и инактивации гена sspB1.В исследовании использовались следующие плазмидные векторы: p7ErmB,pQE-32, pGEMTEasy.Компьютерный анализ проводился с помощью базы данных National Centreof Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и компьютерных8программBLAST,ClustalW2(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov,http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2). Праймеры создавались с помощьюкомпьютерной программы Primer 3.0. G+C состав генов определяли с помощьюпрограммы FastPCR. Статистический анализ осуществлялся с помощьюпрограммы Statistica ver.10.

При представлении нуклеотидной последовательностив виде вторичной структуры использовалась компьютерная программа The mfoldWeb Server (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form). Построениефилогенетического дерева осуществлялось программой MEGA 6, использовалсяметод Maximum Parsimony.ДНК из штаммов СГВ была выделена с использованием фенолхлороформного метода или набора «ДНК-экспресс» («Литех», Россия).ДНК из 10 выделенных от носителей штаммов из Великобритании былавыделена с помощью MagNA Pure Compact сотрудниками центра по защитездоровья (Health Protection Agency) в Лондоне.Масс-спектрометрия была проведена в сотрудничестве с лабораториейбиомедицинской и фармацевтической масс-спектрометрии отдела молекулярноймикробиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН под руководством Мильмана Б.Л.В процессе исследования были использованы следующие методы:полимеразная цепная реакция, электрофорез в агарозном геле, клонирование,ДНК-секвенирование.Результаты исследования и их обсуждениеМолекулярно-генетическая организация и распространенность островапатогенности XIIДля оценки распространенности острова патогенности среди штаммовстрептококков группы В были определены предполагаемые функции 81 генаштаммаNEM316спомощьюгеномнойбазыданныхNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)икомпьютернойпрограммыblastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (поиск белков по транслируемой нуклеотиднойпоследовательности) (рисунок 1).

Гены gbs1374, gbs1375, gbs1376 локализованы запределами острова патогенности XII.Для дальнейшего исследования были выбраны гены gbs1343, gbs1348,gbs1352, gbs1356 (sspB1), gbs1360, gbs1364, gbs1376, кодирующие zeta токсин,белок Zn-finger, метилтрансферазу, SspB1, компонент системы секреции IVCVirB4, компонент системы секреции IVC VirD4, АТФ-зависимую протеазусоответственно. Ген gbs1376 локализован за пределами острова патогенности,поэтому был выбран в качестве положительного контроля ПЦР.Гены острова патогенности XII (PAI XII) были обнаружены в геномах 16 из113 штаммов из России и отсутствовали в зарубежных штаммах (таблица 1). Приэтом организация острова характеризовалась гетерогенностью по составу генов.9Серотипы СГВ штаммов из России, США, Германии оценивали с помощьюмультиплексной ПЦР на гены капсульного оперона (Poyart et al., 2007).Серотипы штаммов из Чешской республики, Великобритании, Португалии иАнголы были известны.Распределение 235 штаммов из названных регионов по серотипампредставлено на рисунке 2.

37 штаммов были отнесены к серотипу Ia, 25 – к Ib, 31– ко II, 56 – к III, 34 – к IV, 18 – к V, 1 – к VI, 1 – к VII, 1 – к VIII.Сопоставление данных мультиплексного типирования с результатамианализа на локализацию генов острова показало, что не существует корреляциимежду наличием острова патогенности XII и серотипом СГВ.Масс-спектрометрический анализ штаммов стрептококков группы ВШтаммы СГВ с островом патогенности XII и без него былипроанализированы с использованием масс-спектрометрии в диапазонемолекулярных весов от 2000 до 18000 Да, однако различия по этому признакумежду штаммами не были выявлены.Создание рекомбинантных конструкций для экспрессии и инактивации генаsspB1В процессе анализа свойств гена sspB1 создана конструкция для экспрессиигена sspB1 с применением экспрессионного вектора pQE-32, которая может бытьиспользована при создании вакцины против стрептококков группы В.Конструкции для инактивации гена sspB1 по односайтовой рекомбинации и подойному кроссинговеру были получены на основе векторов p7ErmB и pGEMTEasyдля определения вклада гена sspB1 в формирование вирулентных свойств СГВ.Сравнительный анализ белков SspB1 и SspB1a с гомологичными белками другихмикроорганизмовВ связи с тем, что существует два гомологичных гена sspB1 и sspB1a вштаммах СГВ, был проведен сравнительный компьютерный анализ белка SspB1 иего гомолога SspB1a.

В результате анализа обнаружили, что белок SspB1a имеетболее высокую степень гомологии со сходными по строению белками другихмикроорганизмов, что свидетельствует о большей распространенности белкаSspB1a по сравнению с белком SspB1. По результатам филогенетического анализаможно сделать предположение о том, что ген, кодирующий белок SspB1,принадлежал к геному общего предка с бактериями, содержащими гомологиSspB1a, после чего в процессе эволюции произошла дивергенция данных генов,которые в настоящее время обнаруживаются в различных штаммах СГВ (рисунок3). Не исключено, что гены sspB1 и sspB1a попали в СГВ из различных хозяев впроцессе горизонтального переноса.10Гены gbs1307, gbs1308, gbs1311, gbs1314, gbs1316, gbs1324, gbs1325, gbs1327, gbs1335, gbs1338, gbs1343, gbs1344, gbs1348,gbs1352, gbs1356, gbs1360, gbs1364, gbs1374, gbs1376 кодируют LmB; ScpB; транспозазу; сайт-специфическую рекомбиназуиз семейства фаговых интеграз; белок, участвующий в репликации плазмиды; рестриктазу типа IIG и метилтрансферазу;сайт-специфическую рекомбиназу из семейства фаговых интеграз; LacX; LacB; релаксазу; zeta токсин; epsilon антитоксин;белок Zn-finger; метилтрансферазу; SspB1; компонент системы секреции IVC VirB4; компонент системы секреции IVCVirD4; рибосомный белок 50S; АТФ-зависимую Clp протеазу соответственно.