Автореферат (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 4

Таким образом, необходимо было охарактеризовать кариотип большего числанезависимо полученных клонов Isp+ и Isp– и выяснить, существует ли корреляциямежду числом копий хромосом II и IX и фенотипом. Для этого в анализ включили клоны наиболее ранних сохранённых в коллекции изолятов исследуемогоштамма, которые мы обозначили p1 (Isp+ ) и m1 (Isp– ). Кроме того, изолят m2пассировали на полной среде и отобрали клон, спонтанно приобретший фенотип Isp+ , или трансформировали m2 мультикопийными плазмидами, содержащими ген SFP1 или SWI1-YFP, после чего отбирали клоны, потерявшие плазмиду ипроявляющие фенотип Isp+ .

Полученный на этом этапе изолят p3 (Isp+ ) пятикратно пассировали на среде, содержащей GuHCl, после чего отбирали супрессорныеклоны в его митотическом потомстве (см. рис. 10). Наконец, из исходных изолятов и полученных клонов выделяли ДНК и анализировали копийность участковгенома с помощью гибридизации с ДНК-микрочипом.eup2p2p1+II, IX+IX+IX p3GuHCl GuHCl+IIm1или+XIV+IXm2 ↑↑ SWI1+II, IX↑↑ SFP1eueueueu+II, IXGuHCl +II, IX+II, IX+II, IX+II, IXРис. 10 — Схема, иллюстрирующая происхождение исследованных изолятов и результаты анализа их кариотипа.

Голубой цвет фона соответствует изолятам фенотипа Isp– ,фиолетовый – фенотипа Isp+ . Сплошная стрелка — спонтанное изменение фенотипа; пунктирная — изменение фенотипа под воздействием указанного фактора. ↑↑SFP1 и ↑↑SWI1 —сверхэкспрессия SFP1 или SWI1-YFP соответственно с последующей потерей плазмиды;GuHCl — пятикратное пассирование на среде, содержащей 5 мМ GuHCl.

Обозначение кариотипа подчёркнуто; + обозначает присутствие дополнительной хромосомы; eu — эуплоид. Изолят p3 обладал лишней хромосомой IX по данным полногеномного секвенированияи лишней хромосомой XIV по данным гибридизации с микрочипом.Полученные данные показывают, что переход между фенотипами Isp+ иIsp в обоих направлениях всегда сопровождается изменением копийности хромосомы II.

Дополнительная копия хромосомы IX, вероятно, возникла при отбореизолята m2 и далее была унаследована его потомками. Интересно отметить, чтов большинстве случаев после сверхэкспрессии SFP1 наблюдали клоны с эуплоидным набором хромосом, однако мы не обнаружили разницы в фенотипе клонов Isp+ с эуплоидным набором хромосом и с дополнительной хромосомой IX.Изоляты Isp– отличались по росту на среде без гистидина: в случае m2 и другихизолятов с дополнительной копией хромосомы IX рост был выражен значительносильнее, чем в случае m1. Фенотип клонов Isp+ разного кариотипа не различался.Приобретение дополнительной хромосомы XIV клоном изолята p3, использованным для гибридизации с микрочипом, вероятно, произошло уже после отбора14–изолятов Isp– .

Эти данные свидетельствуют о нестабильности генома исследуемого штамма.Поиск связи между обработкой гидрохлоридом гуанидина (GuHCl) и изменением кариотипаКак показано ранее, пятикратное пассирование клонов Isp+ штамма25-2В-П3982 на среде, содержащей GuHCl в концентрации 5 мМ, приводит к изменению фенотипа на Isp– (Волков и др., 1997). Это изменение фенотипа внешнесходно с излечиванием дрожжевых прионов, однако не связано с активностьюHsp104 (Volkov et al., 2002), а следовательно, опосредовано иным механизмом.Мы повторили эксперимент по пассированию клонов фенотипа Isp+ на среде сGuHCl и зарегистировали 16 из 332 клонов (12,5%), обладающих фенотипом Isp– .Эти данные отличаются от полученных ранее (Volkov et al., 2002), что заставляет предположить, что наши и более ранние эксперименты были проведены наразном материале.Ранее было показано, что клоны Isp+ более чувствительны к наличиюв среде GuHCl, чем клоны Isp– , причём разница заметна при выращивании натвёрдой среде YEPD, содержащей не менее 5 мМ GuHCl (Volkov et al., 2002).Мы воспроизвели этот результат, а также показали, что потомки клонов Isp+ после пятикратного пассирования на среде с GuHCl становятся более устойчивымик GuHCl, чем контрольные клоны, пассированные на среде YEPD, однако хужерастут на обычной среде YEPD (рис.

11). Некоторые из этих клонов приобретаютфенотип Lys+ (Isp– ). Полученные данные позволяют предположить, что изменение фенотипа клонов Isp+ на Isp– на среде с GuHCl хотя бы частично объясняетсяотбором дисомиков по хромосоме II, более устойчивых к этому веществу.Isp+, контрольIsp+, GuHClIsp–, контрольIsp–, GuHClYEPD-LysYEPD + GuHClРис. 11 — При пассировании клонов Isp+ на среде с GuHCl происходит отбор устойчивых к GuHCl клонов, часть из которых приобретает фенотип Isp– . Показаны потомкиизолятов Isp+ и Isp– после пятикратного пассирования на среде YEPD (контроль) или насреде YEPD, содержащей GuHCl в концентрации 5 мМ.Дополнительная копия his7-1, а также сверхэкспрессия некоторых геновтРНК и гена TEF2 улучшают рост клонов Isp+ на средах без гистидина илилизинаНаши данные показывают, что клоны Isp– отличаются от клонов Isp+ наличием дополнительной хромосомы II.

На этой хромосоме расположены более450 белок-кодирующих генов и 13 генов тРНК. Не менее чем для шести кодирующих белки генов хромосомы II показана связь с регуляцией эффективностинонсенс-супрессии. Кроме того, на этой хромосоме присутствуют гены tQ(UUG)B15и tC(GCA)B, продукты которых могут являться естественными супрессорнымитРНК по отношению к his7-1 (UAA) и lys2-87 (UGA). Наконец, на хромосоме IIлокализованы нонсенс-мутантные аллели his7-1 и lys2-87. Мы более подробноизучили эти три группы генов.Участие криптической мутации sup45-400 в формировании фенотипа Isp+было изучено ранее: введение дополнительной копии sup45-400 на центромерной плазмиде в клоны Isp+ не изменяет их фенотип (Аксенова и др., 2006). Мывоспроизвели этот результат.

Таким образом, дупликация sup45-400 не являетсяпричиной изменения фенотипа.Для проверки возможной зависимости фенотипа от дозы супрессируемойаллели his7-1 мы сконструировали центромерную плазмиду на основе вектораpRS316. При её получении была отобрана дополнительная мутация his7-6, приводящая к замене L316P в His7p, однако данных о важности этой позиции дляактивности фермента нет.

Мы обнаружили, что введение дополнительной копииhis7-1,6 приводит к усилению роста клонов Isp+ на среде без гистидина, хотя ине обеспечивает уровень роста, характерный для клонов Isp– (рис. 12).Isp+, ∅Isp+, his7-1,6Isp–, ∅-Ura-UraHis-UraLysРис. 12 — Введение дополнительной копии his7-1 приводит к усилению роста на среде без гистидина. Показан пример фенотипа трансформантов указанных изолятов.

∅,pRS316. his7-1,6, pRS316-his7-1,6.На хромосоме II локализован ген TEF2, для сверхэкспрессии которогопоказан аллосупрессорный эффект (Valouev et al., 2009), и ген KTI11, делеция которого, согласно литературным данным, снижает эффективность нонсенс-супрессии (Bär et al., 2008). Можно предположить, что наличие в клонах Isp– дополнительной копии каждого из этих генов вносит свой вклад в увеличенную эффективность супрессии his7-1 и lys2-87. Это предположение мы проверили с помощью введения мультикопийных плазмид, несущих эти гены, в штамм Isp+ .

Присверхэкспрессии KTI11 мы не обнаружили влияния на жизнеспособность и эффективность нонсенс-супрессии, а сверхэкспрессия TEF2 приводила к повышенной эффективности супрессии обеих маркерных нонсенс-мутаций, сравнимой стаковой в контрольных клонах Isp– , и к заметному снижению жизнеспособности (рис. 13). Таким образом, сверхэкспрессия TEF2 обладает аллосупрессорнымэффектом по отношению к мутации sup35-25.Наконец, мы предположили, что на супрессию может также влиять изменение дозы генов естественых супрессорных тРНК tQ(UUG)B и tC(GCA)B. Этопредположение проверили с помощью трансформации клонов Isp+ мультикопийными плазмидами, несущими один из этих генов или ген tQ(UUG)L, локализованный на хромосоме XII, однако кодирующий почти идентичную tQ(UUG)Bмолекулу тРНК.

Сверхэкспрессия tQ(UUG)L привела к небольшому повышениюэффективности супрессии his7-1, не сравнимому, тем не менее, с эффективностью16супрессии в клоне Isp– . Аналогичный эффект наблюдали в случае сверхэкспрессии tC(GCA)B и мутации lys2-87 (рис. 13). Эти данные могут говорить об участиигенов tQ(UUG)B и tC(GCA)B, кодирующих естественные супрессорные тРНК, вформировании фенотипа Isp– .-LeuIsp+, ∅Isp–, ∅-LeuHis-LeuLys↑↑ tQ(UUG)L↑↑tQ(UUG)B+Isp↑↑ tC(GCA)B↑↑ TEF2Рис. 13 — Сверхэкспрессия tQ(UUG)L, tC(GCA)B и TEF2 приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии.

Показан пример результатов анализа фенотипа трансформантов Isp+ (p3) и Isp– (m2). ∅, pRS425. ↑↑ — сверхэкспрессия с помощью введениямультикопийной плазмиды. tQ(UUG)L, pRS425-тРНКGln ; ↑↑ tQ(UUG)B, YGPM17c22; ↑↑tC(GCA)B, YGPM18o19.ЗаключениеСовокупность полученных данных позволяет предполагать, что фенотипIsp– (повышенная по сравнению с Isp+ эффективность супрессии нонсенс-мутаций his7-1 и lys2-87) формируется за счёт дупликации самих маркерных аллелей,в результате которой увеличивается количество мРНК his7-1 и lys2-87, а продуктдуплицированного гена TEF2 способствует считыванию стоп-кодонов как значащих.

Нельзя исключить, что нонсенс-супрессия также дополнительно усиливается дупликацией генов естественных супрессорных тРНК tQ(UUG)B и tC(GCA)B.Переход от фенотипа Isp+ к фенотипу Isp– связан с приобретением дополнительной хромосомы II и происходит чаще на среде с GuHCl. Обратный переход связан с потерей этой хромосомы, и его частота увеличивается при сверхэкспрессииSFP1 или SWI1.Isp+GuHClIIII IIeu илиn+1 (IX, XIV)Isp–n+1 (II) илиn+2 (II+IX)Спонтанный переходtQ(UUG)BtQ(UUG)B↑↑SFP1lys2-87TEF2tC(GCA)Blys2-87TEF2tC(GCA)B↑↑SWI1his7-1his7-1↑↑SWI12nРис.