Автореферат (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 3
Описание файла
Файл "Автореферат" внутри архива находится в папке "Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae". PDF-файл из архива "Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 3 страницы из PDF
Тем не менее, не совсем очевидно, каким образом депонированиеэтого транскрипционного фактора в агрегатах может ослаблять нонсенс-супрессию. Поскольку Sfp1p является регулятором транскрипции и может влиять наэкспрессию множества генов, мы проанализировали характер экспрессии геновв изолятах Isp+ , Isp– и sfp1∆ методом гибридизации РНК с ДНК-микрочипом ивыявили гены с изменённой экспрессией (далее — DEG).
Видно, что штамм с делецией SFP1 отличается от каждого из штаммов Isp+ и Isp– намного сильнее (рис.5Б, В), чем последние различаются между собой (рис. 5А).В литературе есть информация о специфичной последовательности, распознаваемой Sfp1p при связывании с ДНК (Zhu et al., 2009).
Обогащённостьпромоторов генов, экспрессия которых изменена в штамме sfp1∆, сайтами связывания Sfp1p хорошо согласуется с литературными данными и подтверждаетадекватность выбранного метода анализа. В то же время, промоторы генов, экспрессия которых различается в клонах Isp+ и Isp– , не обогащены сайтами связывания Sfp1p. Таким образом, активность Sfp1p как транскрипционного фактора визученных клонах Isp+ и Isp– не различается.9Известно, что Sfp1p принимает участие в регуляции экспрессии геновбиогенеза рибосом (Ribi) и генов рибосомных белков (RP) (Jorgensen et al., 2002).Следовательно, уровень экспрессии этих генов можно использовать как показатель, косвенно отражающий активность Sfp1p. Для более детального изучениявопроса о том, связано ли переключение фенотипа с Isp+ на Isp– с изменением вбиогенезе рибосом, мы сравнили список генов, экспрессия которых различаетсяв каждой паре штаммов, со списками генов Ribi (GO:0042254) и генов белковцитоплазматической рибосомы S.
cerevisiae. В то время как в штамме с делецией SFP1 изменяется экспрессия большого количества изучаемых генов (123 из226 генов Ribi и 38 из 138 генов RP при сравнении его с изолятом Isp– ), присравнении клонов Isp+ и Isp– мы выявили лишь два гена с изменённой экспрессией, принадлежащих к этим группам.
Эти данные также свидетельствуют о том,что переход между состояниями Isp+ и Isp– не связан с изменением экспрессиимишеней Sfp1p.-log10pА Isp+ / Isp–Б sfp1Δ / Isp+В sfp1Δ / Isp–101010888666444222n=74n=2580n=1043 n=89900-6 -4 -20246n=787n=986-6 -4 -20246log2 кратности изменения экспрессии-6 -4 -20246Рис. 5 — График рассеяния, показывающий разницу профилей экспрессии генов вкаждой из трёх пар штаммов: Isp+ и Isp– (А), Isp+ и sfp1Δ (Б) и Isp– и sfp1Δ (В).На оси абсцисс отложен двоичный логарифм (abslogFC) от значения кратности измененияэкспрессии, на оси ординат — отрицательный десятичный логарифм скорректированногопо методу Бенджамини-Хохберга p-значения.
Точки выделены красным, если экспрессиясоответствующего гена выше в первом из перечисленных в заголовке штаммов, и зелёным,если во втором. Указано число DEG (p < 0,001, abslogFC > 0,5) в каждом случае.Тем не менее, исследованные изоляты Isp+ и Isp– статистически значиморазличались по экспрессии двух генов из групп Ribi и RP, RPS9A и TMA108. Кроме того, они различались по экспрессии гена CRF1. Этот ген не аннотирован какген Ribi, но его продукт является штаммоспецифичным репрессором транскрипции генов рибосомных белков.
Следует отметить, что экспрессия самого SFP1 вклетках Isp+ и Isp– не различалась. Влияние генов CRF1 и RPS9A на изучаемыйфенотип было решено исследовать более подробно.Поскольку Crf1p может действовать как корепрессор генов рибосомныхбелков, мы проверили, участвует ли ген CRF1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии. Для этого мы инактивировали этот ген в изолятах Isp+ и Isp– .Отобранные клоны с делецией CRF1 по фенотипу не отличались от соответствующих им исходных клонов Isp+ и Isp– , что свидетельствует против участия CRF1в формировании фенотипа Isp+ .10Согласно результатам анализа профилей экспрессии, уровень мРНК генаRPS9A в клетках Isp+ существенно выше, чем в клетках Isp– (рис.
6А). Следует отметить, что различия в уровне экспрессии RPS9A в исследованных клонахразного фенотипа не коррелируют с различиями для других генов рибосомныхбелков: в то время как экспрессия большинства генов рибосомных белков снижается при делеции SFP1 и не различается в клонах Isp+ и Isp– , экспрессия RPS9Aодинакова в изолятах Isp– и sfp1∆, однако значительно выше в изоляте Isp+ . Этотрезультат проверили методом ОТ-ПЦР-РВ, причём изолят Isp+ (p3) получили наоснове изолята Isp– (m2), чтобы обеспечить их максимальное генетическое сходство, и получили сходные данные (рис. 6Б).АRPS9A (транскриптом)ΔCq (отн. ADH1)log2 инт.
свечения***16141210Isp+БРис. 6 — Количество мРНК генаRPS9A в клонах Isp+ повышено посравнению с клонами Isp– . Показаны данные транскриптомного анализа (А) и данные ОТ-ПЦР-РВ (Б).*** — < 0,001 (модифицированный t-критерий с поправкой Бенджамини-Хохберга); ** — < 0,01(критерий Манна-Уитни).RPS9A (ОТ-ПЦР-РВ)**-2-4-6-8Isp–Isp+Isp–Поскольку RPS9A кодирует рибосомный белок S9, изменение его экспрессии может оказывать влияние на процесс трансляции. Мы получили штаммс делецией гена RPS9A и выяснили, что этот штамм не отличается по фенотипуот исходного клона Isp+ (рис.
7). Таким образом, делеция RPS9A не влияет наэффективность нонсенс-супрессии.Isp+, rps9AΔYEPD-His-LysIsp+, контрольIsp–, контрольРис. 7 — Делеция гена RPS9A в клоне Isp+ не влияет на эффективность нонсенссупрессии.Альтернативный подход к проверке влияния гена RPS9A на эффективность нонсенс-супрессии — сверхэкспрессия этого гена.
Мы сконструировали плазмиду, несущую ген RPS9A под контролем сильного конститутивногоGPD-промотора. Введение этой плазмиды в изолят Isp– не привело к изменению фенотипа. Следовательно, ген RPS9A не участвует в контроле эффективности нонсенс-супрессии.Поскольку мы не обнаружили обогащённости промоторов DEG сайтамисвязывания Sfp1p, можно предположить, что прионизация Sfp1p вызывает изменение активности других факторов транскрипции, регулирующих экспрессиювыявленных DEG. Для выявления этих транскрипционных факторов мы провелианализ обогащённости промоторных областей DEG сайтами связывания большинства известных транскрипционных факторов S.
cerevisiae. Гены, экспрессиякоторых повышена в клетках Isp+ , являются мишенями Gcn4p и Aft1p; гены, экс11прессия которых повышена в клетках Isp– , регулируются транскрипционнымифакторами Com2, Gis1, Rgm1, Rph1 и Msn4. В случае с мишенями Msn4p изменение экспрессии генов, вероятно, обусловлено изменением активности его паралога Msn2p, поскольку последовательность MSN4 в геноме изучаемого штаммасодержит стоп-кодон.Для дополнительной характеристики выявленных DEG мы провели ихфункциональную классификацию. Делеция SFP1 снижает экспрессию генов, контролирующих такие биологические процессы, как синтез рибонуклеопротеиновых комплексов (в первую очередь рибосом) и метаболизм некоторых типов РНК.Наши данные об участии SFP1 в регуляции биогенеза рибосом согласуются симеющимися в литературе.Гены, экспрессия которых усилена в клонах Isp+ по сравнению с клонами–Isp , контролируют транспорт ионов металлов, в первую очередь катионов железа, ответ на воздействие феромонов и конъюгацию, биосинтез аминокислот итрансляцию, в то время как гены, экспрессия которых в клонах Isp+ ослаблена,не объединены практически никакими общими функциями.
Данные о функциональной принадлежности генов с усиленной экспрессией в клонах Isp+ хорошосогласуются с результатами анализа их промоторных областей: такие гены являются мишенями Gcn4p и Aft1p. Gcn4p активирует биосинтез аминокислот принедостатке какой-нибудь из них в среде (см. Zaman et al., 2008). Aft1p активирует транспорт железа при недостатке этих ионов (см. Cyert et al., 2013), а приналичии ионов железа диссоциирует от промоторов регулируемых генов (Uetaet al., 2012). Для дополнительной проверки этих данных мы сравнили экспрессию некоторых выявленных DEG, а именно генов FIT2 и FIG1, в изолятах Isp+(p3) и Isp– (m2) с помощью ОТ-ПЦР-РВ. Результаты ОТ-ПЦР-РВ согласуются срезультатами транскриптомного анализа.Усиление экспрессии генов, контролирующих импорт ионов железа, вклонах Isp+ может приводить к изменению чувствительности к недостатку и/илиизбытку ионов железа в среде.
Мы проверили это предположение и не обнаружили разницы в чувствительности к недостатку и избытку железа между клонами Isp+ и Isp– . Вопрос о функциональности усиления экспрессии генов импортажелеза остаётся открытым, поскольку мы не выявили фенотипических отличий,которые могли быть связаны с активацией этих генов.В изоляте Isp– (m2) дуплицированы хромосомы II и IXКак сказано выше, гены, экспрессия которых активирована в клонах Isp–относительно клонов Isp+ , не объединены в функциональные группы. Чтобы найти другие причины, которые могут объяснить полученный список DEG, мы разделили гены по их хромосомной локализации и обнаружили, что гены, экспрессиякоторых повышена в клонах Isp– , преимущественно локализованы на хромосомахII и IX (рис.
8). Эти данные могут свидетельствовать о том, что использованныйизолят Isp– является дисомиком по хромосомам II и IX. Следует отметить, чтопри аналогичном сравнении экспрессии генов в зависимости от их хромосомнойлокализации в клонах sfp1∆ и Isp+ мы не выявили подобной зависимости.12log2 относительной экспрессииРис. 8 — В клонах Isp– усилена экспрессия генов хромосом II и IX. Показан двоичный логарифм отношенияуровней экспрессии генов визолятах Isp– (m2) и Isp+(p2). Горизонтальная пунктирная линия отмечает уровень двукратного увеличения экспрессии.210-1I II IIIIVV VI VII VIII IX XХромосомаXIXIIXIII XIVXVXVIОтносительное покрытиеДля проверки данных о разнице в копийности материала хромосом II иIX мы изучили геномную ДНК одного клона фенотипа Isp+ (p3) и одного клонафенотипа Isp– (m2) с помощью секвенирования.
Выравнивание коротких прочтений на геном S288C позволило нам обнаружить, что относительное покрытие(плотность коротких прочтений, отнесённое к медианному значению плотностикоротких прочтений по геному) для некоторых хромосом заметно отличается отединицы (рис. 9). В случае обоих исследованных изолятов (p3 и m2) такую ситуацию наблюдали для хромосомы IX и только в случае изолята m2 (Isp– ) — дляхромосомы II. Полученные данные позволяют высказать предположение о дисомии изолята m2 по хромосомам II и IX, а также о вероятной смеси клеток с однойи двумя копиями хромосомы IX в изоляте p3.Isp+ (p3)АIsp– (m2)Б322110IIIIIIIVV VII IX XIXIIIXVXIVXVIVI VIII X XIIХромосома0IIIIIIIVV VII IX XIXIIIXVXIVXVIVI VIII X XIIРис.
9 — Плотность коротких прочтений в координатах референсного генома. Показаны результаты анализа выравнивания прочтений геномной ДНК клонов Isp+ (А) и Isp– (Б)на геном штамма S288C. Стрелками отмечены хромосомы с повышенным покрытием.Различная копийность хромосомы II в клонах разного фенотипа представляет особый интерес, т. к. именно на этой хромосоме локализованы гены LYS2 иHIS7, количество продуктов которых в изучаемой системе и определяет способность расти на средах, не содержащих гистидин или лизин.Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp– подтверждаетсвязь между дополнительной копией хромосомы II и фенотипом Isp–Нельзя исключить, что дупликация хромосомы II характерна только дляконкретного изолята m2 (Isp– ), использованного для анализа транскриптома исеквенирования генома, и либо является лишь одним из нескольких способовприобретения фенотипа Isp– , либо вообще не принимает участия в этом процес13се.